茄子杂交种种子纯度 SSR分子标记鉴定技术规程
编制说明
沈阳市农业科学院 2017年5月
《茄子杂交种种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》
标准编制说明
一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作；
2016年6月沈阳市农业科学院向沈阳市质量技术监督局提交《项目建议书》，建议编制《茄子杂交种种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》标准。经审查及公示，项目被列入沈阳市地方标准制修订2016年度计划，沈阳市农业科学院为项目承担单位。项目立项后，项目承担单位成立了标准起草小组，落实了标准起草经费，提供了必要的工作条件。标准起草小组的成员有：刘延斌、杨双、李俊、施骥、孙嘉兴、李雪、胡颖、马东梅、潘菊、闫玲、张健、李金凤、宋伟、朱秋云、赵晓旭、杜野。刘延斌，技术总负责；杨双、李俊、李金凤、马东梅、宋伟，标准样品收集；潘菊、施骥、张健、朱秋云、赵晓旭、杜野，负责技术资料检索；胡颖、孙嘉兴、李雪、闫玲，负责标准技术参数确定。标准起草小组在批准立项的一个月内制定了具体的标准起草计划。按照计划，2016年5月前完成资料收集、相关调研及试验验证；2016年6-8月编制征求意见稿；2016年9月开展书面征求意见；10-12月完成意见整理、分析和处理；17年1-3月填写地方标准征求意见汇总表；2017年4月聘请省内农业专家对征求意见稿进行修改；5-6
月完成意见整理、分析和处理，填写地方标准征求意见汇总表；7月送审；最后根据审查意见形成“标准报批稿”， 报批。
二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的依据。地方标准修订项目，还应列出和原标准主要差异情况；
茄子(Solanum melongena L.)，是一种茄科（Solanceae）茄属（Soalanum L.）植物。茄果可供蔬食。根、茎、叶入药，为收敛剂，有利尿之效，叶也可以作麻醉剂。种子为消肿药，也用为刺激剂，但容易引起胃弱及便秘，果生食可解食菌中毒。原产亚洲热带，中国各省均有栽培。在全世界都有分布，以亚洲栽培最多，占世界总产量74%左右；欧洲次之，占14%左右。中国各地均有栽培，为夏季主要蔬菜之一，目前多数专家认为中国的茄子种质资源丰富，栽培历史悠久，品种繁多，是茄子的第二起源地或栽培驯化中心。茄子已成为我国许多省市县的主要经济支柱作物。但因种子纯度不高造成的减产从而影响经济效益的事件偶有发生，因此种子纯度检测尤为重要。
目前，我国鉴定茄子杂交种子纯度主要依靠田间种植检测法，此方法存在占地多，费时费工且受外界影响大。同工酶分析法受限于酶类的有限性，而且，所选酶的所有基因表达与酶谱存在不一致性，同时酶变异也未必都和形态变异有关，这就使有品种的杂交及亲本不易区别。另外，发育阶段或外界因素的影响对酶谱分析也会带来一些困难。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展， DNA分子标记技术已有数十种，分子标记技术以其分析速度更快、成本更低、信息量更大等
优势在动植物遗传学研究上前景广阔。
SSR (Simple Sequence Repeat，SSR）简单重复序技术，又称为微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸为重复组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。同一类的微卫星可分布于整个基因组的不同位置上。每个位置上重复单位的数目及重复单位序列的差异产生多态性，是一种较为理想的DNA标记技术。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。SSR 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。SSR技术其优点有：①SSR引物能直接从已发表的文献资料、数据库或查找近缘种SSR引物来获得，也能够使用经典的分子生物学方法克隆，可节约大量的时间和精力；②在分子遗传学的研究中，相对来说，SSR分子标记容易扩增，且大多都有相应的软件支持系统，使得微卫星分析变得更加容易；③检测手段简单，规模小，可以进行非损伤取样且可在无放射性的实验室中进行；④试验的重复性高，便于进行数据比较；⑤不同等位位点的应用价值取决于各自的多态性程度，其多态性在研究上通常要比同工酶或异型酶更有价值；⑥一个SSR位点一般包括多个等位基因，具有高度多态性，适合用于分子遗传学研究，而这些多态性则被认为是由于精确的DNA交换或DNA聚合酶的滑动错位所导致的重复单元数变化而造成的，尤其是一些特优种的产生，很可能是通过产生新的等位基因位点出现的；⑦呈孟德尔共显性遗传模式，能够区别纯合显性个体和杂合显性个体，这为遗传学研究提供了更多可供分析的信息。
三、主要试验（或验证）的分析报告、相关技术和经济影响论证、预期的社会经济效益；
1.DNA制备方法筛选
采用植物DNA提取常见方法——树脂型基因组DNA提取试剂盒提取，主要按照说明书要求操作：取单株幼叶100mg左右至2.0ml离心管中，将液氮加入其中并迅速研碎，再加入预热至65℃的CTAB提取缓冲液500 μL，振荡混匀后于65℃水浴1h，期间每隔10min颠倒混匀1次。其余步骤同树脂型基因组DNA提取试剂盒使用说明。最后加入200 μL无菌水溶解极为备用DNA。用0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的DNA质量，结果如附件中图1所示。
2．PCR扩增 2.1 反应体系
总体积15μL，包括8μL 2×Taq PCR Mix (with Dye)、1μL 引物（10 μmol/L）、3μL DNA、2μLddH2O，混匀。 2.2 反应程序
94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸8min；4℃保存。扩增产物用3%琼脂糖凝胶检测，检测的结果重复性好。 2.3 引物筛选及结果
根据前期文献、数据库调研出适用于茄子的33对SSR引物对沈阳农科院自研5个品种进行筛选，以上5个品种暂定编号为沈茄1号至沈茄5号，以每个品种及其父母本的基因组DNA为模板按照所预设