（2）培养基的配制
① 称取母液：首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。吸取量=需要配制培养基的体积×需要配制浓度/母液浓度
② 培养基定容：取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L。
③ 调节pH值：用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.8~6.0。用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。然后放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。
④ 分装：将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约20~30ml，盖上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。 ⑤ 培养基的灭菌：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。 （3） 培养基的灭菌：
利用卧式高压灭菌锅的灭菌步骤，整个过程大概需要2个小时，按以下步骤操作： ①设定压力为0.11Mpa，温度为121℃ ②三开（开出气阀、进水阀、外红阀）
③注水（开水龙头）至离进水显示柱高端1cm左右 ④三关（关出气阀、进水阀、外红阀） ⑤打开电源开关，通电
⑥夹层压力在0.1Mpa以下可以将培养基和无菌水等需要灭菌的物品放入灭菌室⑦夹层压力达到0.1Mpa时打开夹层与灭菌室的开关
⑧夹层与灭菌室同事升温升压，如停止不升温可以手动打开放气阀再放气3~5分钟，待冷空气全部排净就可以升温升压，待达到0.1Mpa、121℃时，灭菌锅会自动保温不会继续升温与升压，这时开始计时15~20分钟，（培养基灭菌需要15~20分钟、无菌水需要20~30分钟）
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⑨时间到，关闭电源，可以慢慢打开出气阀放气
⑩待温度与压力下降，80℃以下时可以将培养基与无菌水等移出灭菌锅备用 五 实验结果：一周后观察试验结果，描述培养基是否凝固及状态、颜色，如果实验失败（培养基不凝固）请分析原因，并自己找时间重新配置。 结果：凝固；胶体态；半透明状。 六 思考题：
1.培养基配置过程中应注意哪些因素？培养基为什么要煮沸后再分装？ 答：培养基配制过程中应注意PH和灭菌；①PH影响外植体和培养材料对离子的吸收，过酸过碱的培养基影响培养材料的生长；此外，琼脂培养基的PH值还影响到培养基的凝固状况。②灭菌，植物组织培养必须在无菌环境中进行。 培养基煮沸后再分装的原因：因为含琼脂的培养基会在40。C左右时凝固，因为要先在水浴中加热，使其成为均匀液态时在尚未冷却情况下尽快分装。
2.调节pH值应该调高0.2-0.3个单位，为什么？
答：因为在高压蒸汽灭菌过程中，培养基中的某些成分会发生分解货氧化，常使培养基的PH值发生一定幅度的变化（PH值常下降约0.1~0.5个单位），PH值变化的方向和幅度取决于多种因素，如培养基成分、浓度、灭菌时间及温度等，因此在设定培养基PH值时应根据实际情况做适当调整。
3.什么因素影响培养基的凝固？灭菌锅的应用应该注意哪些方面？
答：琼脂质量太差或者计算量错误；PH值过酸；灭菌操作参数等因素影响培养基的凝固。灭菌锅的应用应注意：①锅中应放足量的水 ②培养容器要平放，不要过度倾斜 ③灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空 ④随时观察压力及温度情况，保持
压力恒定，当压力达到时要严格控制时间15min ⑤灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归“0”位后才可打开盖或门。
实验二 外植体的消毒及其愈伤组织的诱导
一、实验目的：通过实验，初步掌握外植体材料的消毒、接种的无菌操作技术以
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及外植体愈伤组织的诱导方法。
二、实验原理：植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体植物器官或组织、甚至单个细胞的过程，如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增值的无特定结构和功能的细胞团—愈伤组织，而植物生长调节剂2,4-D是诱导外植体形成愈伤组织的重要影响因素，本实验采用MS培养基添加2,4-D来诱导胡萝卜的愈伤组织。 三、实验材料、试剂及器具 ①材料： 新鲜的胡萝卜块根
②试剂及培养基：0.1%HgCl2（剧毒！小心使用） 、75%乙醇、无菌水 胡萝卜块根愈伤组织诱导的培养基：
MS+2,4-D（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH5.8-6.0
③器具：超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔 四、实验步骤：
①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种。
②将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用解剖刀切去外围组织，切成小块分别置于100ml烧杯中，用75%酒精浸泡30S后，移入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，然后在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将胡萝卜形成层部分横纵切成0.5cm2的小块。以上操作都要在酒精灯火焰旁进行。
③在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将胡萝卜髓部组织小块接种在培养基中，每瓶接种3~4块，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。
④将上述接种有胡萝卜块根的外植体培养瓶置于实验室的培养室内进行培养。并
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整理超净工作台台面。
五、实验结果及分析：1周后观察是否污染，2~3周后观察愈伤组织生长情况并进行简单讨论分析。 六、思考题：
1.在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌对接种工具、接种材料的污染？ 答：①用75%的酒精擦拭手、超净工作台，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻进行杀菌消毒。②将胡萝卜块放进0。1%的氯化汞溶液浸泡8Min，然后用无菌水浸泡两次，一次3min。
2.胡萝卜切块灭菌后为什么要反复清洗？在接种时为什么一定要切割胡萝卜块的外围？切割多大接种才最合适？被接种的部位一定要含有哪种组织，为什么？
答：①由于胡萝卜块经升汞处理过，升汞在外植体表面的残留会导致外植体在培养过程中的坏死甚至培养失败，所以要用无菌水冲洗干净，一般要冲洗5次以上，才可以保证外植体表面的残留升汞最少 ②胡萝卜块的外围表面仍有残留升汞，必须清除，取不与升汞接触的中间部分 ③最适接种面积为横纵切0.5cm2的小块 ④被接种的部位一定要含有形成层，因为形成层的细胞分裂能力强，且基本不携带病毒.全能型也相对比较高，分化程度越高，全能性越低，其他成熟的组织器官已经分化成熟，全能性较低。
实验三 香蕉的继代生芽培养
一、实验目的：学习根据不同的培养目的选择不同的培养基的原理及常规无菌操作方法。
二、实验原理：根据细胞分裂素和生长素的不同比例决定细胞分化方向的原理，利用细胞分裂素比例高于生长素则促进生芽的原理进行香蕉的生芽培养。 三、实验器材与试剂：
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①器材：超净工作台、酒精灯、碟子、镊子、剪刀、解剖刀、标签纸、记号笔 ②试剂：75%乙醇
③香蕉芽的继代生芽培养基：
MS+6BA（5mg/L）+IBA（0.1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L） pH5.8-6.0 四、实验步骤：
①接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行香蕉继代生芽接种。
②在酒精灯火焰旁打开香蕉芽的果酱瓶，用灼烧过的镊子取出3-5簇芽苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每簇芽苗切成分别含有2-3个芽苗的小簇苗，然后再切去芽的尖端。
③用镊子将切好的芽苗插入继代培养基中，每瓶接种3-4个去掉芽顶端的小簇苗。封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。 ④将上述接种的继代香蕉芽置于实验室的培养室内进行光照培养，并整理超净工作台台面。
五、实验结果及分析：一周后观察实验结果并在实验报告上详细写出观察结果并简单分析。 六、思考题：
1.香蕉芽苗的继代培养基配方为什么加入6BA和IBA？
2.接种时为什么要切除顶芽，为什么要2～3个小芽苗一起接种？
实验四 香蕉芽苗的诱导生根
一、实验目的：学习选用生根培养基对已经产生茎芽的植株进行诱导生根的原理及操作方法。
二、实验原理：通过在基本培养基中添加一定物质（活性碳或生长调节剂）来诱导香蕉芽生根，进而使其成为一个完整植株。 三、实验器材与试剂：
①器具：超净工作台、酒精灯、碟子、镊子、剪刀、解剖刀、标签纸、记号笔 ②75%乙醇
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