山东轻工业学院2012届本科毕业设计
摘 要
海藻糖（1-a-D-葡萄糖吡喃糖， a-D-吡喃葡萄糖苷）是由2 个葡萄糖分子通过 α,α→1 ，1 键结合而成的非还原性双糖，广泛分布于植物、昆虫、真菌、酵母和细菌中。海藻糖是一类在干旱、低温、热击或脱水等逆境环境下具有独特抗逆保护作用的二糖
日本科学家在1995年发现了能够以麦芽糖为底物生成海藻糖的海藻糖合成酶。海藻糖合成酶转化反应不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存；而且该酶的特异性较强。只作用于麦芽糖生成海藻糖，麦芽糖对海藻糖的转化率约为70％-80％；原料可由淀粉通过酶转化生产，也可以直接使用价格便宜的麦芽糖糖浆，原料成本可大为降低；由麦芽糖转化成海藻糖仅需一步反应，工艺简单，易于调控。是一种适宜工业化生产海藻糖的方法。
近年来，随着海藻糖的优良特性的不断发现，海藻糖在生物医药、化妆品、食品等各种领域日益展现出诱人的应用前景，引发了人们对海藻糖的生产技术和应用技术开发的热潮。
关键词：麦芽糖 海藻糖 海藻糖合酶
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ABSTRACT
Trehalose (1-a-D-glucopyranosyl a-D-glucopyranoside) is a disaccharide with an a,a-1,1 glycosidic linkage and is widely distributed in plants, insects, fungi, yeast, and bacteria. Trehalose is a kind of disaccharide with a unique protective effect of resistance to drought, low temperature, thermal shock or dehydration stress condition. Japanese scientists discovered trehalose synthase which is capable of producing trehalose with maltose as substrate in 1995.Trehalose synthase reaction does not require consumption of energy, no phosphate coexistent and the enzyme specificity is strong. It only works on maltose formation of trehalose, and maltose on trehalose conversion rate is approximately 70%-80%. raw material from starch by the enzyme into production, or can directly use the cheap price of maltose syrup. Therefore, raw material costs can be greatly reduced and maltose into trehalose by only one step reaction is simple and easy to control. It is a suitable method for industrialized production of trehalose.
Recent years, with the constant discovery of the excellent characteristics of trehalose, trehalose in biological medicine, cosmetics, food and other fields are increasingly showing an attractive application foreground, which leads to a development boom of trehalose production technology and application technology. Key words: Maltose; trehalose; trehalose synthase
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第一章 绪论
1.1 前言
“海藻糖”这个术语源于一种沙漠甘露-虫茧蜜，它是由法国化学家Berthelot发现的(Nwaka & Holzer,1998)。 海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成的非还原性糖。其分子式为 C12H22O11·2H2O ，相对分子量为 378.33，无水海藻糖的分子结构如图1.1所示。
(a) 海藻糖分子的Harworh式
(b) 海藻糖分子的构象式 图1.1 海藻糖的分子结构
Figure1.1 Molecule structure of trehalose
我们通常所说的海藻糖为α,α-型海藻糖，化学名称为α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glycopyranosyl-α-D-glycopyranoside)，也被称作蘑菇糖(Mushroom sugar)，其实它还有两种同分异构体(isomers)，即α,β-型海藻糖(新海藻糖，Neo-Trehalose)和β,β-型海藻糖(异海藻糖，Iso-Trehalose)，只是后两种在自然界很少见[5,6]。目前研究较多的是天然存在的α,α-型海藻糖，它是天然双糖中最稳定的糖类，只被具有特异性的海藻糖酶所分解
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1.1.1 开发背景
海藻糖最初是Wiggers从黑麦的麦角中首次分离出来，后来发现广泛存在于细菌、真菌、藻类及无脊椎动物体内。海藻糖是一种安全的天然糖类，无毒无害，对人体无副作用，具有优质甜味、非着色性、耐酸、耐热、低吸湿性等特性，它还具有其他双糖所没有的独特的生物学特性。当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压等恶劣环境时，胞内海藻糖含量迅速上升，对多种大分子具有保护作用，从而维持生物体生命特性，外源性的海藻糖同样随生物和生物大分子有良好的非特异性保护作用，因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。随着其独特的生物学性质及功能的发现，海藻糖逐渐成为国际上的研究热点。
1.1.2海藻糖的功能特性
1.抗脱水保护功能
海藻糖对逆境（高温、冷冻、干燥、高渗等）具有高抗性，许多含丰富海藻糖的动植物完全干燥失水后仍然维持活性，一旦遇水立刻复活。
关于海藻糖的防脱水机理有以下三种假说：一种以Crowe等人为代表提出的“水替代”假说，他们认为当生物大分子失去维持其结构和功能特性的结构水膜时，海藻糖能在生物分子的失水部位以氢键形式联接，形成一层保护膜以代替失去的结构水膜。另一种为“玻璃态”假说，认为通过海藻糖玻璃化转变的趋势，导致无定形连续相的形成，在结构上与玻璃态的冰相似，在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱。第三种是“优先排阻”假说。以上假说均是从分子角度考察海藻糖的作用机理，基本上都是与生物分子形成“分子复合物。
2.抗辐射功能
海藻糖可保护细胞DNA不被放射性物质损伤。据报道，当存在10mmol海藻糖时，DNA可忍受4倍剂量的β，γ-射线，糖含量越高，保护作用越强。其机理为：射线引起的DNA断裂反应主要是由周围水分子解离产生的羟基自由基引发的，而海藻糖可有效的清除。
3.提高植物的抗寒、抗盐功能
经海藻糖处理的绿豆幼苗质膜上Mg2+、K+-ATPase的活性显著提高。用0.1%的海藻糖溶液浸水稻种，经2℃和6℃低温处理后，水稻幼苗细胞电解质渗透率显著降低，而淀粉酶活性及幼苗可溶性糖含量则提高，对寒害的修复能力也提高。而且处理温度愈低，海藻糖的相对效应就愈显著。用海藻糖预处理的小麦幼苗在NaCl溶液中生长，其细胞电解质渗透率和游离脯氨酸的含量均显著降低，而叶绿素的含量、根系活力、干物质的积累和生长速度则提高。这是因为海藻糖能在作物遭受低温、盐害而脱水时，维持了细胞膜结构的稳定性，从而提高了作物的抗逆能力。
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4.其他功能
海藻糖还具有抗冷冻保护功能、防止淀粉老化、防止蛋白质变性、防蛀牙、稳定组织细胞结构与保鲜效果、稳定物料中超氧化物歧化酶等诸多功能。
1.1.3海藻糖的生产方法
海藻糖的生产方法目前主要有微生物抽提法、微生物发酵法、酶转化法以及基因工程法几种。
1.微生物抽提法
该方法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其他一些含海藻糖的菌体为原料，通过干燥、改变渗透压等方法进行处理，然后经过乙醇等有机溶剂抽提、精制，从而得到较高纯度的海藻糖晶体。最初是由欧美等国从面包酵母中抽提获得。后期随着工艺的不断改进，已较为成熟，成为生产海藻糖的重要方法，但是由于提取资源有限，成本高，很大程度上制约着海藻糖大规模工业化生产。
2.微生物发酵法
该方法是以酵母、诺卡氏菌属、微球菌属等微生物经过诱变、细胞融合或基因重组选育出高产海藻糖的菌株，在高浓度或高渗基质上发酵培养，再从发酵液中提取精制而成。日本首先从发酵液中提取海藻糖，提取率可达到88.6%，同时纯度达到99.5%。国内杭州商学院在研究开发深层灰树花中提取海藻糖也已获得突破性进展。缺点是转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖提取、精制困难。
3.酶转化法
酶转化法制取海藻糖的途径有多种，根据作用底物不同主要分为三种，分别为以葡萄糖为底物、以麦芽糖为底物和以淀粉为底物。
（1）以葡萄糖为底物
利用专一性很强的葡萄糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，经两步作用将两个葡萄糖分子转化为海藻糖。但在整个反应过程中需要消耗高能物质UDP或GDP，所以很难实现大规模工业化生产。
（2）以麦芽糖为底物
利用麦芽糖磷酸化酶、海藻糖磷酸酶共同作用麦芽糖或海藻糖合成酶单独作用于麦芽糖生成海藻糖。其中海藻糖合成酶在催化过程中不需要消耗高能物质，并且不需要磷酸且转化率高达70%~80%，这为海藻糖的大规模生产提供了有利条件。
（3）以淀粉为底物
1995年日本林原生化研究所报道了他们发现的两种新酶低聚麦芽糖基海藻糖合成酶(MTSase)和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase)共同作用，可以由淀粉直接通过酶法生成海藻糖，在支链淀粉酶的协同作用下，海藻糖转化率高达85%。该方法的发现使每公斤海藻糖由数万日元降至数百元。
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