真核生物的翻译
蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5' 端的“帽子” 参与形成翻译起始复合物。 真核生物的翻译的起始因子：
eIF2 3种亚基 形成三元起始复合体(eIF2,GTP,tRNA) eIF2-A 65kd Met-tRNAmet与40S亚基结合 eIF1 15kd 促使mRNA与40S亚基结合 eIF3 ＞500kd 促使mRNA与40S亚基结合 eIF4b 80kd 促使mRNA与40S亚基结合 eIF4a 50kd 促使与mRNA，GTP结合 eIF4c 19kd 促使两亚基结合 eIF5 150kd 释放eIF2，eIF3
eIF4e(eIF4f的亚基) 与5’端帽子结合 4.4.3 肽链的延伸
过程：后续AA-tRNA与核糖体结合，肽链的生成，移位 延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物) EF-1,EF-2(真核生物) 2个GTP
后续AA-tRNA与核糖体结合
细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰-tRNA首先与EF-Tu · GTP形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮循环。 肽键的生成
核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，
fMet-tRNAfMet
占据P位。在肽基转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，
与fMet-tRNAfMet
上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。 移位
肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA 3' 端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA2从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。 4.4.4 肽链的终止 终止因子：
原核生物有3种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于识别终止密码子UAA、UAG；RF2帮助识别UAA、UAG；RF3不识别终止密码子，主要是协助肽的释放。一旦tRNA从核糖体上脱落，则核糖体立即离开mRNA，并解离成50S和30S亚基，核糖体可以重复使用。 真核生物仅一种：RF
4.4.5 蛋白质前体的加工 1.N端fMet或Met的切除
2.二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成
3.特定氨基酸的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化
4.切除新生肽链中的非功能片段 糖蛋白中常见的糖—肽连接键： N—糖苷键：β-N-乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰(GlcNAc-Asn) O—糖苷键：α-N-乙酰氨基半乳糖基-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)
4.4.6 蛋白质合成的抑制剂 1.抗生素类阻断剂：
链霉素、卡那霉素、新霉素等：竞争性抑制蛋白质合成 四环素和土霉素：四环素阻止氨酰-tRNA转移到A位置 氯霉素：阻断50S亚基的活性 嘌呤霉素(Puromycin)
白喉霉素(diphtheria toxin)：与延长因子发生作用 2.干扰素对病毒蛋白合成的抑制： 从白细胞中得到α-干扰素，从成纤维细胞中得到β-干扰素，在免疫细胞中得到γ-干扰素。
抗生素抑制蛋白质生物合成的原理 抗生素 作用点 作用原理 四环素族 原核核蛋白体抑制氨酰- tRNA与小亚基结合 小亚基 氯霉素 原核核蛋白体抑制转肽酶，阻断延长 大亚基 链霉素/卡原核核蛋白体改变构象引起读码错，抑制起始 那霉素 小亚基 嘌呤霉素 原、真核核蛋抑制转肽酶，妨碍移位 白体大亚基 放线菌酮 真核核蛋白体抑制转肽酶，阻断延长 大亚基 红霉素 原核核糖体大阻断移位，阻断Pro合成延长 亚基 4.4.7 RNA分子在生物进化中的地位 RNA在生命起源中的地位及其演化过程 生命是自我复制的体系：
三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。
核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。 由RNA催化产生了蛋白质
DNA代替了RNA的遗传信息功能 DNA双链比RNA单链稳定；
DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链的尿嘧啶，使之易于修复。 蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能
蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；
与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。 4.5 蛋白质运转机制 蛋白质运转类别
若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；
若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。
这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。
4.5.1 翻译—运转同步机制 信号序列(signal sequence)：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为信号序列。
信号肽(signal peptide)：绝大多数越膜蛋白的N端都具有长度大约在13-36个残基之间的以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。 信号肽的结构特点：
1.一般带有10-15个疏水氨基酸
2.常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸
3.在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)
信号序列的基本作用：
1.通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合 2.通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运SRP & DP 信号识别颗粒(signal recognition partical，SRP)：是一种核糖核酸蛋白复合体，它的作用是识别信号序列，并将核糖体引导到内质网上。 停靠蛋白(docking protein，DP，又称SRP受体蛋白)：即SRP在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合，使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。
信号肽假说(signal hypothesis)：
提出：G.Blobel & B.Dobborstein(1975) 证明：基因重组实验 核心内容：核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。
已知野生型细胞中，β-半乳糖酶定位于胞质内，麦芽糖结合蛋白定位于胞外，麦芽糖运转蛋白位于外膜内腔。如果把β-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白的氨基端基因片段相连，并以此为模板指导合成杂种蛋白质，就可以通过测定β-半乳糖酶的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。 4.5.2 翻译后运转机制 1.线粒体蛋白质的跨膜运输 2.叶绿体蛋白质的跨膜运输 翻译后运转机制
线粒体蛋白质的跨膜运转
通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。这个过程有如下特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽（leader peptide）共同组成。 ②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程；③蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或
MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。 前导肽的作用与性质
拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。
前导肽一般具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）α-螺旋结构的能力。 叶绿体蛋白质的跨膜运转
叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中，蛋白质运转是在翻译后进行的，在运转过程中没有蛋白质的合成。 叶绿体蛋白质运转过程有如下特点：
①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。
②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。
③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。 4.5.3 核定位蛋白的运转机制 核定位序列（NLS—Nuclear Localization Sequence） NLS可以位于核蛋白的任何部位。
蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子包括核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。由上述三个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。
细菌同样能通过定位于蛋白质N-端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、外膜、双层膜之间或细胞外等不同部位。4.5.4 蛋白质的降解
在大肠杆菌中，蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一个肽键要消耗两个分子的ATP。
成熟蛋白N-端的第一个氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物）在蛋白的降解中有着举足轻重的影响（表4-16）。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3分钟就被降解了。 在真核生物中，蛋白质的降解依赖于泛蛋白（Ubiquitin），该蛋白只有76个氨基酸残基，序列高度保守（从酵母和人细胞中提取的泛蛋白几乎完全相同！），生物细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛蛋白相连。这个过程需有E1、E2、E3三个降解因子参与。一旦被降解蛋白与
泛蛋白相连接，这个复合体就能被运送到分子量高达
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的蛋白降解体系中直到完全降解。 习题
1.遗传密码的摆动性是指: A.遗传密码可以互换
B.密码第3位碱基与反密码的第1位碱基可以不严格互补 C.一种密码可以代表不同的氨基酸
D.密码与反密码可任意配对 E.不同氨基酸具有相同密码 2.反密码子IGC可以识别的密码子是: A.GCG B.GCA C.ACG D.ICG
3.关于tRNA的叙述,下列哪项是错误的: A.有反密码子,能识别mRNA分子的密码
B.由氨基酸臂携带氨基酸C.一种tRNA能携带多种氨基酸 D.一种氨基酸可由数种特定的tRNA运载 E.20种氨基酸都各有其特定的tRNA
4.真核生物的翻译起始复合物在何处形成? A.起始密码子AUG处 B.5’末端的帽子结构 C.TATA框 D.CAAT框
5.合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是: A.脯氨酸 B.羟脯氨酸 C.丝氨酸 D.赖氨酸
6.下列哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质生物合成?
A.环己酰亚胺(放线菌酮) B.氯霉素 C.四环素 D.链霉素 E.嘌呤霉素
7.细胞合成的分泌蛋白质在N端都有一段信号肽,这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基:
A.大于100 B.15到30 C.约50 D.小于10
8.信号识别颗粒(signal recognition particle)的作用: A.指导RNA剪切 B.引导分泌蛋白质跨膜
C.指引核糖体大小亚基结合 D.直到转录终止 5 分子生物学研究法
现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步使分子生物学研究在上世纪中叶开始高速发展。 5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件 上世纪分子生物学研究取得的三大成就：
第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题； 第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
1.DNA是遗传物质的实验
40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； Hershey和Chase（1952）的噬菌体侵染细菌实验
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3. 50年代末至60年代，相继提出了\中心法则\和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和
表达。 但是：当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。 重组DNA技术（recombination）： 是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 工具酶：
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） DNA连接酶（DNA ligase）
工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史最重要的事件 两大技术保证：
1.DNA的体外切割和连接
重组DNA实验中常见的主要工具酶 酶类 功能 限制性核酸内识别并在特定位点切开DNA 切酶 DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子 DNA聚合酶I按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平（大肠杆菌） DNA双链中的缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接 末端转移酶 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 III λ噬菌体从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 DNA外切酶 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团 2.DNA的核苷酸序列分析技术
DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作，都有着十分广泛的使用价值。 重组DNA实验中常见的主要工具酶 分子生物学研究的核心技术 基因操作（gene manipulation）：DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。 基因工程（gene engineering）：在体外将核酸分子接入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内而能持续的繁殖。 5.2 DNA操作技术 5.2.1 核酸的凝胶电泳
v 电泳的基本原理：一种带电粒子在电场中，会以一定的速度移向与它自身带相反电荷的电极。我们把这种电泳分
子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
v 核酸的凝胶电泳：糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 v 影响迁移率的四大因素: 一、分子物理性质： 分子大小：大的迁移快
电荷多少：电荷密度大的迁移快
构形：闭环(CCC)>单链开环(OC) >线性(L) 二、支持介质：
在电泳中常用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等，其分子的迁移率与分子的摩擦系数成反比。其中，摩擦系数与凝胶密度相关。 三、电场强度：
电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但当电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。电场强度愈大，带电颗粒的泳动速度愈快。 四、缓冲液离子强度：
缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。常用的缓冲体系有Tris-醋酸（TAE）、 Tris-硼酸（ TBE ）、 Tris-磷酸（ TPE ）三种。以TAE最为常用，价格低且其缓冲能力低，需经常更新
脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，简称PFGE）:用于分离超大分子量（甚至是整条染色体）DNA。 在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45°夹角，而第二个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45°夹角 。
应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。 核酸电泳的指示剂:
电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈蓝色。
溴酚蓝的分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为554.6Da，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶电泳中，迁移率比溴酚蓝慢。 核酸电泳的染色剂:
溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。
溴化乙锭不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合。 在适当的染色条件下（0.5 ug/ml），荧光强度与DNA片段的大小（或数量）成正比。 5.2.2 核酸的分子杂交
定义：核酸杂交（Nucleic acid hybridization）：是指具有一
定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原
则重新配对形成双链的过程。 原理：DNA的变性和复性 在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturation）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。 DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。 影响杂交的主要因素： 温度：一般在低于Tm约15至25度的温度杂交速率最快。 盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺。
硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。 核酸探针的类型
1 克隆的DNA片段，常用cDNA探针。 2 RNA探针（Riboprobe）
RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。 3 寡核苷酸探针
可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。 4 聚合酶链反应扩增产物
是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。 核酸标记的类型：
放射性同位素：32P, 35S , 33P；目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。
常用核酸杂交技术：滤膜杂交、固相杂交、原位杂交、核酸杂交、液相杂交。
滤膜杂交：是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程
1. 核酸探针的制备和标记； 2. 核酸片段的凝胶电泳分离；
3. 将凝胶中的核酸片段通过印迹（blot）转移到某种固相支持物上；
4. 用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交； 5. 洗膜（除去未杂交的游离探针等）；
6. 检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）。 常见的几种滤膜杂交 1. Southern印迹：指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段
转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。
Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。
2.Northern印迹：是指RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。
基本过程包括：RNA的提取、RNA变性电泳、RNA转移和固定、杂交、检测。
除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外，其余基本与Southern印迹 同，关键是减少实验中的RNA酶污染。 Northern blotting（诺赛恩RNA印迹技术）
是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 3 蛋白质杂交技术（Western blotting）：又称为immunoblotting，指将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应的技术。 基因探针(probe)：就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分，可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA 探针的种类：基因组探针(genomic probe)；cDNA探针(cDNA probe)；寡核苷酸探针(人工合成的)。
探针的标记：放射性同位素：如32P；非同位素：如生物素、地高辛。
理想标记物特点，一种理想的标记物，应具备以下特性：①高度灵敏性；②标记物与核酸探分子的结合，应绝对不能影响其碱基配对特异性；③应不影响探针分子的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性，杂交体的Tm应无较大的改变；④检测方法具有高度特异性。
1.放射性同位素：灵敏度和特异性高、应用广泛；易造成放射性污染、半衰期短。如32P、3H和35S。
2.非放射性同位素:无放射性污染，稳定性好；灵敏度和特异性不太高。半抗原、配体结合生物素、地高辛和荧光素。 Probe synthesis：Nick Translation切口平移法、Random Priming随机引物合成法、End labeling末端标记法。 5.2.3 细菌转化
细菌转化:是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
感受态细胞:处于能够接受外源DNA状态的细胞称为。 步 骤：
1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。 2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。
3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。
4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复。
5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。 5.2.4 核苷酸序列分析
1968年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略
Sanger在它的基础上发展了快速测定DNA的末端终止法 K Mullis完善了PCR扩增DNA方法 1、Sanger双脱氧链终止法
这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。 由于ddTTP没有3'-OH基团，寡核苷酸链不再继续延长，在本该由dTTP掺入的位置上发生了特异性的链终止效应。 2、Maxam-Gilbert化学修饰法
用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生的一组具有各种不同长度的DNA片段的反应混合物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。 Gilbert & Maxam的化学修饰法 G系统： pH 8.0
硫酸二甲酯 → G → m7G →C8~C9断裂 →脱G A+G系统：pH 2.0
哌啶甲酸（pidine）→ 嘌呤环 N质子化→ 脱嘌呤 C系统: 1.5 mol/L NaCl C + 肼（hydrazine）→ 脱C T + C系统:
肼(hydrazine) → 打开嘧啶环 →重新5C环化→脱嘧啶 3. DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化
3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。
4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2.自动测序仪
Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。
红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP） 3、DNA序列分析的自动化
采用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。 电泳过程中，当DNA条带在电场的作用下，经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA在激光的激发下便产生了荧光。
4、DNA杂交测序法（SBH）
用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。