的背景是黑的，物体的边缘是亮的。
? 可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。
在日常生活中，当人的眼睛处于暗处观察光线斜射到的尘埃，由于光的反射和衍射，使尘埃颗粒似乎增大体积而可辨别。但当光线很强或有衍射存在的情况下则看不出尘埃的颗粒。根据此原理使光木直接通过样品而是斜射到样品上，即可在暗视野下观察细微粒子。
暗视野显微镜（dark field microscope）使用了一种特殊的照明方法，使光线不能直接进入物镜和目镜，这样，在观察样品时就不能直接看到照明光线，而只能观察被检物体所反射或衍射的光线，因而使被检物体在黑暗的视野中呈现明亮的像。这种照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。
暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。 ----------------王p36 （五）、相差显微镜 Phase-contrast microscope，PCM
把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1. 环形光阑（annular diaphragm）:位于光源与聚光器之间。
2. 相位板（annular phaseplate）:物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
相差显微镜（phase contrast microscop）是荷兰科学家 Zermike于 1935年发明的，用于观察未染色样品。相差显微镜的优点是能观察无色、透明、活细胞中的结构。它是利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。
相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同。
小的、未经染色的样品（如活细胞）是难以用普通光学显微镜进行观察的，而相差显微镜使得高通透性的物体变得可见。在普通光学显微镜中，我们之所以能够区别一个物体的不同部分，是因为它们对光产生不同的影响，影响的根本原因就是光的衍射。细胞器是由各种不同的分子，如 DNA、 RNA。蛋白质、脂、糖类、盐和水构成的，不同成分的不同部分很可能有不同的光衍射系数。在正常情况下，不同衍射系数的差异不能被我们的肉眼所区别，但是相差显微镜能够将这种衍射差异转变成明与暗的差异，这样就可以用肉眼区分了。这种转变要依靠光波的相互作用的能力即干涉（interference）。
相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能：①将直射的光（视野中背景光）与经物体衍射的光分开；②能将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。假定将某一物体悬浮在相同的介质中，也就是说它们的各个部分的衍射系数完全相同，此时到达物体上的所有光都有一半被改变了相位，相互之间的干涉是一致的，强度的减少也是一致的。
为了更好地理解相差显微镜的工作原理，首先必须明白一束光是由许多单个的射线组成的。当来自于光源的射线通过样品时，它们各自的速度将会受到样品的物理性质的影响。尤其是射线衍射时，它们到达样品上的相位就会发生某种程度的改变，结果是由于相位的改变，使那些已经通过了样品的射线同那些本来就没有通过样品的射线一起离开了相位。
所谓相位是光波在前进时，电振动呈现的交替的波形变化。由于光是电磁波，其电振动与磁振动垂直，又与波的传播方向垂直，导致了传播时波形的变化。同一种光波通过折射率不同的物质时，光的相位就会发生变化，波长和振幅也会发生变化。所谓相差是指两束光波在某一位置时，由于波峰和波谷不一致，即存在着相位
21
上的差异，叫相差。同一种光通过细胞时，由于细胞不同部分的折射率木同，通过细胞的光线比末通过细胞的光线相位落后，而通过细胞核的光线比通过细胞其他部位的相位落后，这就是相位差。
另外，光通过物体后形成两束光，一束直行，称为直射光，另一束斜行或绕行称为衍射光，衍射光相位落后，振幅小。两束光继续前进，当直射光和衍射光相遇时又产生干涉，此时如两者相位相同则两束光的合光振幅加大，若两者相位相反，则两束光的合光振幅减小。合光振幅大意味着物体变亮，合光振幅小则物体变暗，结果是物体在显微镜下呈现明暗对比，因而能藉以辨认无色透明物体内的细微结构。
（六）、微分干涉差显微镜Differential interference contrast microscope （DIC）
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast（DIC） microscope）。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。首先DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。－－－－绍兴
（七）、倒置显微镜Inverse microscope
物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。
当代显微镜的发展趋势：采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体；自动化与电子化。
1.2 Electron Microscope
1.2.1Transmission electron microscope, TEM 1、基本原理
光显的分辨率主要是受照明光线的波长限制，在可见光源下无法分辨小干0.2μm的细微结构，即使改用紫外光源，也只能是0.1μm。提高分辨率的最好办法就是缩短照明光源的波长，这导致了电子显微镜（electron microscope）的发明。光源与分辨率的关系同样适于电子束，由于电子束的波长比光的波长短100 000倍，因而用电子束代替光波，可大大提高显微镜的分辨率。1932年德国学者Knolls和Ruska发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界．发现了许多光镜下看不到的结 构．如细胞膜、线粒体、细胞核、高尔基体、中心粒等
22
细胞器的细微结构。将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)．或超微结构。电子显微镜与光学显微镜在总体结构的设计上有很大的差别）。在种类上，电镜可分为两大类：透射电子显微镜和扫描电子显微镜。还有在这两类电子显微镜的基础上发展起来的具有特别功能的电子显微镜，如透光学员微镜电子显微镜射扫描电子显微镜、免疫电子显微镜、高压电子显微镜等。 －－－－－－－－王p39
在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），目前TEM的分辨力可达0.2nm。
电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有50nm的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。－－－绍兴
（1） 透射电子显微镜与光学显微镜的基本区别
显微 分辨本领 200nm LM 100nm 紫外光（约200nm） 玻璃透镜 不要求真空 真空 TEM 0.1nm 电子束（0.01-0.9） 电磁透镜 1.33x10-5光源 透镜 真空 不要求真空 成像原理 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形～成明暗反差 可见光（400-700） 玻璃透镜 1.33x10P -3 23
（2）TEM特点：
?以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。
? 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 ? 分辨率0.2nm，放大倍数可达百万倍。
? 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 2制样技术
1）超薄切片技术：Ultrathin section
? 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机(ultramicrotome)制作。
? 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属(铀、铅)盐染色。
2）负染色技术：Negative staining
?用重金属盐（如磷钨酸钠）对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包理的样品颗粒则透明光亮，从而出现负染效果，分辨率可达1.5nm左右。
3）冷冻断裂复型技术和冷冻蚀刻：Freeze-fracture replication,Freeze etching
是专门观察样品外表面的投影复型术。冷冻断裂复型（ freeze－fracture replication）技术是先将生物样品在液氮中（－196℃）进行快速冷冻，防止形成冰晶。然后将冷冻的样品迅速转移到冷冻装置中，并迅速抽成真空。在真空条件下，用冰刀横切冷冻样品，使样品的内层被分开露出两个表面。如用冰刀切开细胞膜时，分开的两个面分别称为 P面（protoplasmic face）和 E面（exoplasmic face）， P面是靠近细胞质一面的半层膜，而E面则是靠近细胞外基质一I面的半层膜，可清楚地观察到镶嵌蛋白。
冷冻蚀刻（freeze－etching）技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察
1.2.2 扫描电子显微镜Scanning electron microscope, CEM
?20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
? 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。
工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。
? 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
24
1.2.3扫描隧道显微镜Scanning tunneling microscope，STM
扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope， STM）由 IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者Binning和Rohrer等在1981年发明的具有原子显像力的显微镜，是根据量子力学中的隧道效应原理而制成的。这种显微镜对生物学、物理学、化学等学科均有推动作用，可用于研究表面的原子结构和电子结构，故于1986年获得了诺贝尔物理学奖。 -----王
扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有一指数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。
利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。－－－－－绍兴
(Scanning Tunnelling Microscopy)是利用电子穿隧效应而发展出来的。如果两电极(一极为金属探针（一般为钨针），另一极为导电样品)相距很近，并在其间加上微小电压，则探针所在的位置便有穿隧电流产生。
利用探针与样品表面的间距和穿隧电流有十分灵敏的关系，当探针以设定的高度扫描样品表面时，由于表面的高低变化，导致探针和样品表面的间距时大时小，穿隧电流值也随之改变。藉探针在样品表面上来回扫描，并记录在每一位置点上的穿遂电流值，便可得知样品表面原子排列的情形。因此，扫描穿隧显微镜是研究导电样品表面原子性质的有利工具。 ?特点：
a．高分辨率。
b．扫描隧道显微镜可直接探测样品的表面结构，可绘出立体三维结构图像。 c．扫描隧道显微镜可在真空、常压、空气，甚至溶液中探测物质的结构。
d．扫描隧道显微镜的扫描速度快，获取数据的时间短，成像也快，有可能开展生命过程的动力学研究。 e.不需任何透镜，体积小，携带方便。 2 Analysis of Cellular Component 2.1 Centrifugation
离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。
（一）、差速离心（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器）。
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重
25