陕西省水电医院检验科 免疫室SOP文件 责任部门：检验科 文件编号:SDYYJYK-SOP-MY1 版序：001 时间：2015-01-01 页码：第20页共99页 免疫实验室操作步骤 （一）甲型肝炎病毒IgM抗体（HAV-IgM） 1． 检验目的：检测人血清或血浆中的抗HAV-IgM。 2． 检测原理：本品系用抗人-IgM（u链）包被的微孔板，配以纯甲型肝炎抗原（HAV-Ag）
和酶标记的甲型肝炎病毒抗体（抗HAV-HRP）及其它试剂，采用捕获法原理，检测人血清或血浆中的抗-HAV-IgM。 3． 试剂：上海科华生物工程股份有限公司 组分名称 HAV-IgM微孔板 HAV-IgM酶标记抗体 数量 1块 1支 规格 48T×1 3.2mL 1.0mL 2.2 mL 组分名称 底物A 底物B 封口膜 浓缩洗涤液 说明书 数量 1支 1支 3张 1支 1份 规格 4.0 mL 4.0 mL 3.5 mL 30 mL HAV-IgM阳性对照血清 1支 HAV-IgM阴性对照血清 1支 甲肝抗原 自封袋 1支 1个 1 .0mL 终止液（2MH2SO4） 1支 4． 操作： 4.1 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有结晶析出应充分溶解）浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 4.2 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 4.3 加样：待测样本用生理盐水作1：1000稀释，每个样本检测孔加入稀释样本100 uL。设阴阳对照各1孔，每孔加入100 uL，并设空白对照1孔。 4.4 温育：置37℃温育20分钟，室温平衡2分钟。 4.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 4.6 加抗原、酶：每孔加入抗原（HAV-Ag）30 uL、酶标记抗体50uL（1滴），充分混匀。 4.7 温育：置37℃温育20分钟。 4.8 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 4.9 显色：每孔加底物A、B各50uL，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。 4.10 终止：每孔加终止液50uL，混匀。 4.11 测定：用酶标仪单波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定需设定空白对照一孔，30分钟完成测定，并记录结果）。 制定人 修改人 审核人 批准人 批准日期 陕西省水电医院检验科 免疫室SOP文件 责任部门：检验科 文件编号:SDYYJYK-SOP-MY1 版序：001 时间：2015-01-01 页码：第21页共99页 5. 结果判定： 5.1 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1 阴性对照OD值低于0.050←0.050计算，高于0.050按实际OD值计算。 5.2结果判定：样品OD值S/C.O.≥1者为HAV-IgM阳性 样品OD值S/C.O.＜1者为HAV-IgM阴性 5.3 失效：如果阳性对照OD均值小于0.05，则表明不正常的操作或试剂盒已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。 6. 标本： 6.1 静脉抽取空腹患者标本3.0 mL（真空管采血），将血液放置水浴箱中30分钟后，分离血清。 6.2 溶血标本不能用于检测。 6.3 用完的标本，应在样品管上注明日期，放置在2—8℃冰箱中保存一周。 6.4 样品放置一周后，逐管加入1：50的84消毒液，并放置4小时后，装入医疗垃圾袋由医院专人按医疗垃圾处理。 7. 注意事项 7.1 本试剂盒仅用于体外诊断试验.进用于人血清或血浆样本,其它体液和样品可能得不到准确的结果. 7.2 请勿使用溶血标本.样本加样量对本实验极为重要,建议使用精密加样器准确加样.并经常对精密加样器进行校准. 7.3 每板建议设阴、阳性对照血清各两孔,设空白对照时,不加样品及酶标记抗体,其余各步相同. 7.4 洗涤时各孔均需加满,防止孔内有游离酶未能洗净. 7.5 加试剂前应将试剂瓶翻转数次,使液体混匀. 7.6 实验环境应保持一定湿度,避风.避免在过高温度下进行实验. 7.7 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关.任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在. 7.8 试剂各组分在正当处理和保存的情况下直至校期都保持稳定,不能使用过校期的试剂盒.不同品名、不同批号的试剂不可混用,以免产生错误结果. 制定人 修改人 审核人 批准人 批准日期 陕西省水电医院检验科 免疫室SOP文件 责任部门：检验科 文件编号:SDYYJYK-SOP-MY1 版序：001 时间：2015-01-01 页码：第22页共99页 (二)乙型肝炎病毒（HBV） 1、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 1 .检验目的：检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg），其阳性者为急性乙型肝炎潜伏期或急性、慢性乙肝患者，无症状HBsAg携带者。 2. 检验原理：在微孔条上预包被纯化乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HBsAb—HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg） 3. 试剂：英科新创（厦门）科技有限公司。 3.1 HBsAg微孔板（96人份） 3.2 HBsAg酶标记抗体 3.3 HBsAg阳性对照血清 3.4 HBsAg阴性对照血清 3.5 浓缩洗涤液 25ml 3.6 底物 A 3.7 底物 B 3.8 终止液（2M H2SO4） 3.9 封口膜 3.10 自封袋 4. 试剂的贮存： 直接使用，2~8℃贮存至失效期避免阳光直射。 5.操作： 5.1 平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18℃—25℃），微孔板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 5.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 5.4 加样：每孔中加入稀释液20 uL，病人血清100 uL，设阴、阳性对照各1孔，每孔加入100 uL，空白对照1孔。 5.5 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。 5.6 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30—60秒的浸泡时间）。 5.7 加酶：每孔加入酶50 uL，温浴30min 洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干 5.8 显色：每孔加底物A、B各50uL，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。 5.9 终止：每孔加终止液50uL，混匀。 5.10 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。 制定人 修改人 审核人 批准人 批准日期 陕西省水电医院检验科 免疫室SOP文件 责任部门：检验科 文件编号:SDYYJYK-SOP-MY1 版序：001 时间：2015-01-01 页码：第23页共99页 6. 结果判定 6.1 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1 阴性对照OD均值大于0.1或阳性对照小于0.4时应重新试验，小于0.05时以0.05计算 6.2 结果判定：样品OD值S/C.O.≥1者为HBsAg阳性 样品OD 值S/C.O.＜1者为HBsAg阴性 7.标本： 7.1静脉抽取空腹患者标本3.0mL（真空采血管），将血液放置在37℃水浴中30分钟后，分离血清。 7.2 溶血标本不能用于检测。 7.3 用完的标本，应在样品管上注明日期，放置在2—8℃冰箱中保存一周。 7.4 样品放置一周后，逐管加入1：50的84消毒液，并放置4小时后，装入医疗垃圾袋由医院专人按医疗垃圾处理。 8.注意事项 8.1 每板建议设阴、阳性对照血清各两孔，设空白对照时，不加样品及酶标记抗体，其余各步相同。 8.2 洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 8.3 加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。如果滴加，滴加前应弃去1—2滴。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。注意勿将试剂滴在孔壁上。 8.4 所有样品都应按传染源处理。 8.5 样品显色深浅与样品中抗原的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗原存在。 8.6 封口膜使用说明：（1）微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条低部，以免影响其透光性。 （2）微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其它因素对实验带来的非预期的影响。 8.7 不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。 制定人 修改人 审核人 批准人 批准日期 陕西省水电医院检验科 免疫室SOP文件 责任部门：检验科 文件编号:SDYYJYK-SOP-MY1 版序：001 时间：2015-01-01 页码：第24页共99页 2、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb） 1 .检验目的：检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗体（HBsAb），其为保护性抗体，大多数急性病人恢复期后为阳性，接种乙肝疫苗后产生免疫力。 2. 检验原理：在微孔条上预包被纯化乙肝表面抗原（HBsAg），配以酶标记抗体（HBsAg—HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗体（HBsAb） 3. 试剂：英科新创（厦门）科技有限公司。 3.1 HBsAb微孔板（96人份） 3.2 HBsAb酶标记抗原 3.3 HBsAb阳性对照血清 3.4 HBsAb阴性对照血清 3.5 浓缩洗涤液 25ml 3.6 底物 A 3.7 底物 B 3.8 终止液（2M H2SO4） 3.9 封口膜 3.10 自封袋 4. 试剂的贮存： 直接使用，2~8℃贮存至失效期，避免阳光直射。 5.操作： 5.1 平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18℃—25℃），微孔板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 5.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 5.4 加样：用加样器加入待测血清50uL，设阴、阳性对照各1孔，每孔加入50 uL，空白对照1孔。 5.5 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗原50uL；轻拍混匀。 5.6 温育：置37℃温育30分钟，室温平衡5分钟。 5.7 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30—60秒的浸泡时间）。 5.8 显色：每孔加底物A、B各50uL，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。 5.9 终止：每孔加终止液50uL，混匀。 5.10 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。 制定人 修改人 审核人 批准人 批准日期