1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本来源实验用的31株MRSA标本来源于2007年3月至2007年12月间西安交通大学医学院第一、第二附属医院的住院患者。
1.1.2实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位>2000u/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。
1.2方法
1.2.1细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA，同时用PCR检测mecA基因，凡头孢西丁(FOX，30μg)纸片药敏试验≤19mm的金黄色葡萄球菌，且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药，即为MRSA。
1.2.2PCR引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物：HVR引物序列为，P1：5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′，P2：5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1]，RAPD引物序列为，EP007：5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2]，KAY1：5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。
1.2.3细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤，提取葡萄球菌基因组DNA。
1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：HVR P1和P2引物各1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃ 60s，56℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析结果。
1.2.5MRSA的RAPD分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：RAPD引物EP007 1μL(引物浓度10μmol/L)，RAPD引物KAY1 1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性2min;94℃ 45s，34℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中进行成像分析。
2结果
2.1MRSA的HVR-PCR分型结果应用HVR-PCR方法对31株MRSA标本进行分型，一共可以分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs。所有的MRSA都可以扩增出长度450～820bp的基因片段，用HVR-PCR分型方法都可以加以区分，分型率达到了100%。DRUs的数目=(扩增的基因片段长度-171)/40，其中171是存在于扩增序列之中而没有重复的序列片段长度，40是每一个正向重复单元序列的长度。所有MRSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。结果见图1、表1。
2.2MRSA的RAPD分型结果
2.2.1RAPD的电泳结果31株MRSA经过RAPD两条引物混合扩增分型，均可得到数量不等、位置不同的扩增条带，条带数目在1～6条之间，分型率达100%(图2)。图1MRSA的HVR-PCR电泳图Fig.1 The electrophoresis result of HVR-PCR of MRSAM：100bp ladder DNA Marker;1、3、6、10： PCR产物长531bp，9DRUs型;2、7：PCR产物长571bp，10DRUs型;4、9：PCR产物长611bp，11DRUs型;5、8：PCR产物长651bp，12DRUs型。表1HVR-PCR的分型结果