1.3 仪器
FACScan-420型流式细胞仪，美国Beckton Dickinson公司产品。
2 方法
2.1 动物分组与造模50只健康雄性SD大鼠，饲养于18～22℃明暗各12 h的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为5组，即：正常对照组（简称正常组），模型对照组（简称模型组），消瘀化痰方高、低剂量组（简称高、低剂量组），阳性药（东宝肝泰）对照组（简称对照组）。动物造模参照文献［3］喂饲高脂饲料，高脂饲料由1.5%胆固醇、0.5%胆盐、10%猪油和88%基础饲料制成。除正常组喂饲普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料，连续9周。
2.2 给药方法及标本处理大鼠造模的同时，各组分别给予相应药物灌胃，给药剂量按药理实验方法学计算，消瘀化痰方高、低剂量组分别按43.34，21.67 g/kg体重的标准灌服，对照组按0.9 g/kg体重的标准灌服，正常组和模型组灌服生理盐水。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1 ml/100 g计算。实验9周末，最后1次给药后禁食12 h麻醉状态下迅速剖取肝脏，在肝脏最大叶距边缘0.5 cm处取少许肝组织，生理盐水洗净血液，滤纸吸干水分，70％乙醇溶液固定，4℃冰箱冷贮待检。另在相同部位取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝组织浸泡于4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织形态变化。
2.3 指标检测
2.3.1 肝组织形态学观察取大鼠部分肝组织用4% 的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。
2.3.2 肝细胞凋亡及肝组织Caspase 3蛋白表达的流式细胞术分析单细胞悬液的制备：取已固定肝组织放于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，轻搓组织，边搓边以PBS液冲洗，直至将组织搓完。将平皿中的混悬液用300目筛网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，1 000 r/min，离心3 min，弃上清，保留沉淀，加入PBS 0.3 ml，稀释混匀后，将单细胞悬液分成2份，调整每份样品的细胞数为1×106，用于检测肝细胞凋亡情况。
细胞凋亡DNA含量染色：采用PI一步插入性DNA定量荧光染色方法，染液中含PI 50 μg/ml，RNA酶100 μg/ml，Triton-X 100 1.0%。取上述制备的单细胞悬液1份，加入PI－DNA荧光染色液1 ml，置4℃冰箱染色30 min，以500目筛网过滤后上机检测。测量的数据输入计算机，应用Expo32ADC软件进行免疫荧光数据分析，用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。采用Barlogie的细胞图解法分析，将处于不同时期的细胞分为3部分，即：G0/G1期、S期、G2/M期，根据DNA含量直方图，由计算机计算出各时相的分布比率，并计算细胞增殖指数（PI）。为保证仪器的精度和实验条件的稳定性，检测前以flow-checkTMFluorpheres（10 μm）荧光微球（REF6605359.Be-ckman Couiter，Inc.Fullerton，CA 92835）作为标准样品调整仪器CV值在2％以内。
Caspase 3蛋白免疫荧光样品的制备：将1×106个细胞以PBS洗涤2次，2 min/次，离心2 min，弃上清液，加入1∶100的鼠抗人Caspase 3蛋白单克隆抗体100 μl，30℃温育30 min，用PBS离心洗涤2次，弃上清液，加入1∶100的羊抗鼠FITC-IgG 100 μl，37℃温育30 min，离心洗涤2次取上清液，除去未结合的多余荧光抗体，上机前加入1.0 ml PBS液，经400目滤网过滤即可上机检测。
2.4 资料计算方法细胞凋亡指数（apopyotic index，AP）表示细胞凋亡程度，计算10 000个细胞中出现的凋亡细胞数，并计算出百分比。细胞增殖指数（proliferation index，PI）表示细胞增殖活性，计算方法为：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。免疫荧光指数（fluorescence index，FI）表示蛋白表达水平，计算方法为：FI=样品蛋白表达的平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度。