【摘要】 目的 观察腺相关病毒(AAV)介导人转化生长因子β1（hTGFβ1）基因体内转染羊椎间盘后，对其Ⅱ型胶原的影响。方法 SPF级山羊8只，共取椎间盘32个，实验组、对照组各16个。实验组椎间盘显微注射AAV?hTGFβ1，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。术后4周对山羊腰椎间盘行免疫组织化学观察，采用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果 实验组Ⅱ型胶原表达明显高于对照组，差异有统计学意义（t=3.521,P＜0.05）。结论 AAV?hTGFβ1基因体内转染后能提高椎间盘细胞Ⅱ型胶原的表达。
【关键词】 转化生长因子β 胶原Ⅱ型 椎间盘
［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effect of hTGFβ1 encoding gene mediated by adeno?associated virus (AAV) on the collagen Ⅱof the nucleus pulposus cells of intervertebral disc of goat.MethodsThirty?two intervertebral discs from eight goats were evenly divided into two groups: group Ⅰ treated with AAV?hTGFβ1 injection and group Ⅱ with 0.01 mol/L PBS injection. Four weeks after treatment, immunohistochemistry staining and VIDAS analysis were applied to semiquantitatively analyze the expression of collagen Ⅱ.ResultsThe expression of collagenⅡin group Ⅰ was significantly stronger than that of group Ⅱ （t=3.521,P<0.05).ConclusionTransfer of AAV?hTGFβ1 into the intervertebral discs could enhance the expression of collagenⅡin the nucleus pulposus.
［KEY WORDS］transforming growth factor beta; collagen typeⅡ; intervertebral disk
腰椎间盘退变是腰背痛的重要病因，它是一个复杂的过程，其发生的病因和机制目前尚有较大争议。目前的治疗手段主要是对症治疗，包括保守治疗和手术治疗，前者常出现复发，而后者为有创治疗，会破坏脊柱的稳定性和完整性，伴有许多并发症[1]。随着分子生物学的迅速发展，基因治疗为我们在细胞、分子水平上延缓或逆转椎间盘退变提供了可能。基因治疗是将调解基因导入椎间盘细胞中，以期获得长期疗效。1997年WEHLING等[2]首先提出了转基因逆转椎间盘退变的设想，将目的基因转染体外培养的牛椎间盘软骨终板的软骨细胞。1999年NISHIDA等[3]证实，腺相关病毒介导的人转化生长因子β1(AAV?hTGFβ1)基因可以成功导入兔椎间盘中，基因表达蛋白合成持续3个月未发现明显减少，转染的椎间盘较对照椎间盘合成hTGFβ1增多，蛋白多糖合成率增高。本研究采用AAV?hTGFβ1体内转染羊椎间盘髓核细胞的方法，观察其对Ⅱ型胶原合成的生物学效应。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康成年SPF级山羊8只,由青岛大学医学院附属医院动物实验室提供，雌雄各4只，（10.5±0.5）月龄，平均体质量为（30.2±3.8）kg。随机分为两组，每组4只。在标准饲养条件下适应性饲养2周。AAV?hTGFβ1由北京本元正阳基因技术有限公司提供。Collagen TypeⅡ抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验方法
术前禁饮食36～48 h，术前将阿托品0.03～0. 05 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg及地西泮10 mg肌肉注射，氯胺酮1～2 mg/kg静脉缓慢推注给药。山羊取右侧卧位，经腹膜后入路暴露腰椎间盘，任意选相连的4个椎间盘，实验组对应髓核用显微注射器各注射AAV?hTGFβ1 50 μL，对照组对应髓核注 射磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L）50 μL，在相应椎体的横突用金属线作标记，逐层缝合。动物术前及术后3 d肌注青霉素160万单位，术后室内休养3 d。第4周处死山羊,共得到椎间盘32个，实验组、对照组各16个。立即用40 g/L的多聚甲醛固定1周，EDTA脱钙处理，石蜡包埋，切成6 μm厚的切片。免疫组织化学染色后光学显微镜观察，VIDAS图像分析系统测定其阳性产物的平均吸光度值，用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。