1材料与方法
1.1试剂及其来源
淫羊藿总黄酮由深圳中药及创新药物研究中心提供; DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);PCR逆转录试剂盒购自Promega公司(美国);SYBR Green购自Bio Rad公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司;其余均为AR级;MES23.5细胞由乐卫东教授(美国贝勒医学院)提供。
1.2细胞培养及药物处理
MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基于37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下培养。细胞汇合达80%~90%时，分为对照组(A组)、MPP+组(B组)、淫羊藿总黄酮+ MPP+组(C组)。
1.3MTT法检测细胞生长
将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，采用MPP+处理细胞24 h，或淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，再采用MPP+处理24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT溶液20 μL，于37 ℃含体积分数0.05 CO2培养箱继续培养4 h。每孔加入DMSO溶液100 μL，混匀后用酶标仪检测570 nm处的吸光度(A)值，计算细胞存活率。
1.4实时反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测bcl-2和bax基因的表达
将传代细胞接种于6孔板中，用MPP+处理细胞24 h，或淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，再用MPP+处理细胞24 h，采用Trizol法从细胞中提取总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录。采用SYBR Green染料法相对定量检测bcl-2、bax和GAPDH 的基因表达。bcl-2上游引物序列为5′-CCTGTGG-ATGACTGAGTACC-3′;下游引物序列为5′-CCCA- CTCGTAGCCCCTCT-3′。bax上游引物序列为5′-GGCGAATTGGAGATGAAC-3′;下游引物序列为5′-CCGAAGTAGGAGAGGAGG-3′。GAPDH上游引物序列为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′;下游引物序列为5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTA-T-3′。用未处理的样本做标准曲线，计算出靶基因的含量，并与内参基因GAPDH相比。
1.5统计学分析
计量资料以±s表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)并继以Tukey法进行两两比较。
2结果
2.1不同浓度MPP+对MES23.5细胞的毒性作用及淫羊藿总黄酮的保护作用
MES23.5细胞经0、10、50、100、200及400 μmol/L的MPP+处理24 h，细胞存活率分别为1.000±0.019、0.983±0.065、0.797±0.055、0.753±0.081，0.689±0.080及0.580±0.110。MPP+可剂量依赖性地降低MES23.5细胞的存活率(F=15.03，P<0.001)。用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h，可明显降低100 μmol/L MPP+毒性作用(F=44.36，q=4.284,P<0.001)。见表1。
2.2淫羊藿总黄酮对MPP+诱导的bcl-2基因表达的影响
100 μmol/L MPP+ 处理细胞24 h,可引起bcl-2基因表达的轻微降低，但差异没有统计学意义。应用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，可明显增加bcl-2基因的表达，与A、B组相比，差异有极显著意义(F=15.76，q=6.112、7.445,P<0.05、0.01)。见表1。
2.3淫羊藿总黄酮对MPP+诱导的bax基因表达的影响
100 μmol/L MPP+可明显增加bax基因的表达，而应用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理后，bax基因的表达较B组明显降低(F=10.92,q=5.842,P<0.05)。见表1。表1淫羊藿总黄酮预处理对MPP+诱导的MES23.5细胞存活率、bcl-2和bax基因表达的影响
3讨论
PD是中枢神经系统退行性疾病，是国际亟待攻克病因及治疗的老年性疾病。研究显示，MPP+能够增加氧化应激、诱导细胞凋亡，是公认的可以诱发多巴胺能神经元变性的神经毒素[7]。MES23.5细胞是一种杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系,是由大鼠的胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤-胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成，可替代原代培养的多巴胺神经元用于研究神经变性疾病PD[8]。本文应用MPP+损伤细胞MES23.5这一多巴胺能神经元细胞系，研究淫羊藿总黄酮的神经保护作用及其机制。