2.1.4 测定方法分别精密吸取“2.1.2”项下各溶液1 ml，挥干溶剂，加入新鲜配制的0.5％茴香醛-浓硫酸乙醇液0.5 ml，100℃水浴15 min，取出冷却，加入无水乙醇5.0 ml，茴香醛-浓硫酸乙醇液做空白，于350～800 nm波长进行扫描，比较3类物质对测定方法的影响。
测定结果显示，在429 nm（±1nm）附近菝葜皂苷元和总皂苷均有明显吸收峰，糖类在此处均无明显吸收（图1），说明糖类对茴香醛-浓硫酸法干扰很小；在同等条件下，15种氨基酸在429 nm（±1 nm）附近也均无明显吸收（图1），且曲线均在基线附近，说明氨基酸对茴香醛-硫酸法基本没有影响。图2显示，两种黄酮在429 nm（±1 nm）附近均有吸收峰末端，但吸收不是很大，说明黄酮类物质对茴香醛-硫酸法有一定的影响。
2.2 茴香醛-硫酸法比色条件的优化
2.2.1 正交实验法优选茴香醛-硫酸法比色条件设计L9（34）正交表对显色剂浓度、反应时间、反应温度、显色剂体积4因素进行考察。水平因素见表1，测定结果及极差分析见表2，方差分析及最小二乘法分析结果见表3～4。表1 正交实验因素水平表（略）表2 正交实验测定结果及极差分析结果（略）表3 正交实验结果方差分析表（略）表4 各因素水平最小二乘法平均值（略）
从分析结果的R值得出，4因素对测定结果的影响顺序为反应温度＞显色剂体积＞反应时间＞显色剂浓度，最优显色条件为A3B2C3D1，即5%茴香醛无水乙醇液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。
查F值分布表可知，F0.05(2,2)=19.0，F0.01(2,2)=99.0，根据方差检验判断标准，当F值大于F0.05小于等于F0.01时，该因素作用显著，记为“*”。从表3得知，4个因素的F值均大于F0.05(2,2)小于F0.01(2,2)，因此判定4个因素对实验影响均较为显著，根据F值大小排序，可以看到4个因素的影响次序为反应温度＞显色剂体积＞反应时间＞显色剂浓度，其结果与极差分析结果相吻合。
由表4中看到，取各因素最小二乘法平均值中的最大值，得到条件为显色剂浓度5%，反应时间30 min，反应温度100℃，显色剂用量0.2 ml，其结果与极差分析结果吻合。
在实验过程中发现数据中5%茴香醛乙醇溶液与1%两个浓度的差别很小，且5%对茴香醛用量较大，如果用1%浓度代替5%浓度，会大大节省显色剂用量，因此在进行最优工艺验证时，同时对1%浓度条件进行了平行实验，以观察两种浓度的差异。
2.2.2 最优比色条件验证精密吸取“2.1.1”项下菝葜皂苷元溶液1 ml共10份，分别置于10支具塞试管中，挥干溶剂，试管从1～10标号，其中1～5号试管加入5%茴香醛乙醇溶液0.2 ml，6～10号试管中加入1%茴香醛溶液0.2 ml，100℃水浴30 min，取出冷却，于429 nm下测定吸光度。结果见表5。表5 最优比色条件验证结果（略）
对上表两组数据进行双样本t检验，结果P=0.118>0.05，表明两组实验方差是一致的，两种浓度之间无显著差异。从测得的吸光度来看，两种浓度显色剂的吸光度值均超过了正交实验数据，符合正交实验结果。因此将显色剂浓度换为1%茴香醛乙醇是可行的。这也从另一角度说明1%的浓度已基本能够反应完全，而过量的茴香醛反而造成不必要的浪费。
综上所述，最后确定茴香醛-浓硫酸法显色条件为1%茴香醛无水乙醇溶液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。
3 结论
考察了糖类、氨基酸及黄酮类对茴香醛-硫酸法测定芦笋边角料中总皂苷含量时的干扰［10］，在429 nm处菝葜皂苷元与芦笋总皂苷均有明显的吸收，而糖类和氨基酸几乎没有吸收，黄酮类有较小的末端吸收。结果说明，糖类和氨基酸对本法的干扰较小，黄酮类有一定干扰，为了准确测定芦笋中总皂苷含量，测定时可以考虑用差示分光光度法来扣除类黄酮物质的干扰。其余6种常见比色法的同步研究结果表明［8］，糖类对乙酸酐浓硫酸法、浓硫酸法及香草醛-高氯酸法影响较大、而3类物质对高氯酸法、香草醛-硫酸法及对二甲氨基苯甲醛法均影响较大，干扰明显。因此，茴香醛-浓硫酸法对总皂苷测定专属性要强于其余6种方法，另外，茴香醛法中，菝葜皂苷元与总皂苷在测定波长429 nm处呈现明确的吸收峰，响应明显，通过数次重复实验，此吸收峰较为稳定，优于其余方法。