11．一个果蝇卵它的仇bcd－／bcd－ 可以正常发育，但成虫将不能有可成活的后代，为什么？ 12．为什么把色氨酸称为色氨酸操纵子的辅阻遏物？
13．为什么核糖体 RNA的合成与核糖体蛋白质的合成是相互协调的？
14．当向E．coli培养基中同时加人乳糖和葡萄糖时，大肠杆菌优先利用哪种糖？为什么？ 15．在细菌操纵子调控中，转录水平调控的基本模式是什么（有几种）？ 16．阿拉伯糖操纵子的结构及调节机理是什么？
17．大肠杆菌色氨酸操纵子的结构及调节机理是什么？ 18．真核生物基因大部分使用正调节机制的原因是什么？ 1．
(a)尽管补加色氨酸，色氨酸合成酶仍保持高水平活性。 (b)色氨酸合成酶仍保持高水平活性。
(c）色氨酸合成酶水平迅速下降，防止多余色氨酸的合成。 2．
(a)造成Lac操纵子的组成型表达，因为大部分这种突变使阻遏子不能结合操纵基因。
(b)如果Lac 突变，产生无活性的阻遏子蛋白，也会造成操纵子的组成型表达。如果突变使阻遏蛋白丧失结合诱导物异构乳糖的能力，将造成操纵子的永久性阻遏。
(c）一10顺序用打开 DNA双链形成开放复合物。这种突变降低转录水平或永久性阻遏转录。
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3．根据提示，人的基因组DNA含量为2×2．4×10bp（双倍体），比大肠杆菌基因组大约1000倍。因次，要使阻遏子在人基因组内保持象在大肠杆菌细胞内那么高水平的阻遏，大约需要 10 × 1000=10 000拷贝的阻遏子蛋白。 4．细胞中阻遏子浓度=(10×1000)/(6.02×1023) × 1/(2×10-12)=8×10-9（mol／L）
这个浓度约比阻遏子与操纵基因复合物解离常数大105倍。因此，如果细胞内有10拷贝的活性阻遏子，我们可以推断细胞内的操纵基因位点总是被阻遏子所占据（亦即有很高的抑制率）。 5．
(a)表达减少。因高水平的葡萄糖降低了。AMP的水平，使CAP不被激活。正调控受到抑制，故乳糖操纵子表达减少。 (b)由这个突变造成乳糖操纵子的永久性阻遏，乳糖操纵子表达会减少。
(c)由于p一半乳糖普酶被灭火，乳糖不能被转变为异构乳糖，即乳糖操纵子失去了诱导物，因而表达水平降低。 (d)如果突变造成CAP蛋白不能结合启动子位点，它将失去促进RNA转录的作用。乳糖操纵子的表达将降低。 (e)如果一个突变完全灭火半乳糖旮透过酶，乳糖不能进入细胞，因而使操纵子没有诱导物，表达会减少。 6．
(a)增加前导肽基因和顺序2的距离造成核糖在顺序1延误更长的时间，使顺序2总是能和顺序3配对；使顺序3和顺序4之间的终止子结构不能形成，因而转录弱化作用被减弱（或失效）。
(b)增加顺序2和3之间的距离能使顺序3和4之间形成衰减子的机会增加。即便顺序2不被核糖所占据，因而转录会减少。 (c)除去顺序4将使色氨酸操纵子的衰弱机制完全丧失。操纵子的表达将完全依据阻遏子的负调节控制。
(d)如把前导肽基因中的两个色氨酸密码变成组氨酸密码，这个衰减机制将丧失对色氨酸浓度的敏感性而变成对组氨酸敏感。
(e)消除前导肽基因中的核糖体结合位点，顺序2和顺序3将总能形成互补结构而阻止顺序3和4之间的终止子结构形成，衰减机制将失效。
(f)如果这种情况发生，不管细胞中色氨酸浓度多少，顺序3和4之间的衰减子总能形成，转录减少。 7．如果 lex A基因突变导致 LexA蛋白不发生自切割，因而 LexA蛋白在发生大量 DNA损伤的情况下仍然阻遏与SOS相关的基因产生SOS蛋白，不能使细胞适应这种紧急情况。细胞将无法应付这种局面，而使细胞对高水平的 DNA损伤更敏感（更易于被杀死）。 8．如果Hin重组酶变得更加活泼，每个世代大肠杆菌细胞的鞭毛会由两种鞭毛蛋白组成， 细胞将很容易受到寄主产生的两种抗体的攻击。 9．在纯化过程中，酶活性所需的一种可解离因子丢失，例如，大肠杆菌RNA聚合酶的。因子丢失，使RNA聚合酶失去活性。
11．子代卵发育所需的 bcd mRNA是由母亲提供的。所以，bcd－／bcd一的卵能正常发育，因为母亲有正常的bcd基因。如果成虫的基因型是bcd－／bcd－，它将是不育的，因为它没有正常的 bcd mRNA提供给子代。
12．游离的色氨酸操纵子的阻遏子不能与DNA的特定顺序结合。当色氨酸与阻遏子结合后，诱导阻遏子构象的改变，才使阻遏子形成了能与DNA专一性结合的表面，起到阻遏转录的作用。 13．当营养丰富时，细菌细胞生长速度加快，核糖体的数量增加；当氨基酸浓度太低时，tRNA不能被氨酸化，氨基酸饥饿导致无负载的 tRNA结合于核糖体的 A位点。这个反应激发了一系列事件，一个被称为“应急因子”的蛋白质结合于核糖体，并催化合成ppGpp；ppGpp（信号分子之一）与 RNA聚合酶结合抑制 RNA聚合酶，降低 RNA的合成（即在转录起始水平上抑制 rRNA的合成）。
为核糖体蛋白（r－protein）编码的55个基因分布在至少20个操纵子中，每个操纵子含有1～11个基因。有些操纵子还含有引物酶，RNA聚合酶和蛋白质合成的延长因子的基因，说明细胞生长过程、DNA复制、转录和蛋白质合成是紧密偶联的。
每个含有核糖体蛋白的操纵子其核糖体蛋白同时也是翻译阻遏子。它能和从这个操纵子转录的 mRNA结合以阻止翻译。而起阻遏子作用的核糖体蛋白一般能和 rRNA结合。作为翻译阻遏子的核糖体蛋白与rRNA相结合的亲和力大大超过它对mRNA的亲和力。如果核糖体蛋白大大超过细胞内存在的rRNA所能结合的数量，此时核糖体蛋白才和mRNA结合。采取这种方法，为核糖体蛋白编码的mRNA，其翻译产生的核糖体蛋白如果超过组装核糖体的需要，它的翻译就会受到抑制。使之与细胞所含有的rRNA保持平衡。被翻译阻遏子结合的mRNA上的位点靠近操纵子中这个基因翻译的起始点（通常是第一个基因）。在大多数操纵子中这种结合可能只影响第一个基因，因为细菌大多数是多顺反子mRNA。其后的基因都有独立翻译信号，但是在这种操纵子中，每个基因的翻译依赖于所有其他基因的翻译。这种翻译偶联（机制未知）使得整个操纵子在单一mRNA位点受到翻译阻遏子结合后都受到抑制。已经证明核糖体蛋白的合成与可用的rRNA数量是相协调的。 14．优先利用葡萄糖，因葡萄糖代谢的产物使cAMP水平下降，cAMP水平降低，干扰了cAMP－CAP复合物的形成；后者是乳糖操纵子转录的必需成分。当葡萄糖耗尽后，cAMP水平升高，促进 cAMP－CAP复合物的形成，同时，一些乳糖已进入细胞，被β一半乳糖普酶代谢产生异构乳糖；异构乳糖与操纵子的阻遏子结合，使阻遏子构象改变，从操纵基因上解离下来，操纵子的结构基因得以表达，乳糖得以利用。 15．是正调控和负调控。阻遏子对操纵子的作用一般为负调控，因其活性状态抑制操纵子的转录。(a)阻遏子在没有分子信号时结合于操纵基因。外部信号引起阻遏子的解离，造成转录开始。(b)阻遏子在信号小分子存在时结合于操纵基因。当信号分子除去时，阻遏子解离，转录开始。
激活子蛋白对操纵子的作用为正调控，因其活性状态能开启它所控制的操纵子基因的转录。激活子通常情况下受信号分子的调节，如 CAP蛋白；当信号分子 3'，5'－cAMP和激活子结合后，激活子才和DNA结合而促进转录。
16．阿拉伯糖操纵子的结构见《现代生物化学》P393。（a）当阿拉伯糖被除去时，ara C基因从它自己的启动子转录。(b)当葡萄糖水平高，阿拉伯糖水平低时，ara C蛋白结合于 ara O2和 ara I的半位点，形成一个 DNA环阻止 ara BAD转录。(c)当有阿拉伯糖存在而葡萄糖浓度低时，ara C和阿拉伯糖结合并改变构象成为激活子。DNA环被打开，ara C和 ara I，ara O1每个半位点都结合，串联的蛋白相互作用，并和 CAP－cAMP蛋白协调促进从ara BAD基因的转录。
17．该操纵子的结构见《现代生物化学》P395，色氨酸（Trp）阻遏蛋白是个同亚基二聚体。当色氨酸丰富时，色氨酸和色氨酸阻遏子结合，引起阻遏子的构象改变，使阻遏子结合于操纵基因上。色氨酸操纵基因的顺序和启动子的顺序相交盖。因此阻遏子对操纵基因的结合阻止RNA聚合酶对启动子的结合，抑制转录。
色氨酸操纵子还受到衰减子机制的调节。色氨酸操纵子的衰减机制是使用有162个核甘酸残基的RNA前导顺序进行的。这个前导顺序位于操纵子 mRNA的 5'一末端，在第一个结构基因的起始密码子的前面。这前导顺序可被分成1，2，3，4号顺序。3号与 4号顺序之间能通过碱基配对形成茎环结构。在其茎部富含 G三C碱基而其 3'一端有一个多尿嘧啶核苷酸串列。这种结构实际上是一个不依赖ρ因子的转录终止子。当这种结构形成时，转录受到阻碍。
前导顺序中的一号顺序是个能感觉色氨酸浓度的关键元件。它含有多个色氨酸密码子，可以看成是色氨酸传感器。它决定着3号顺序是与4号顺序还是和2号顺序配对。当色氨酸浓度高时，携带色氨酸的tRNA（Trp－tRNA）浓度也高，翻译就可紧跟着转录而通过多个色氨酸密码，在3号顺序合成之前进入2号顺序。在这种情况下，2号顺序被核糖体所覆盖因而不能跟随后合成的3号顺序配对，终止子结构就可以在3，4号顺序之间形成，转录就可被阻止。当色氨酸浓度很稀时，由于缺少携带色氨酸的 tRNA，核糖体被滞留在两个色氨酸密码子上，此时2号顺序能自由的和3号顺序配对，因此转录就可继续进行。以这种方法，转录可以随着色氨酸浓度进行衰减调节。 18．
（1）染色质内储存的DNA使大部分启动子具有不可接触性。因此，在其他调节作用不在的时候基因总是沉默的。染色质结构造成许多启动子难以接触，而阻遏子与DNA结合以阻止RNA聚合酶对启动子的接近（起负调节作用）就显得多余了。
（2）真核基因组太大，调节蛋白对特殊DNA顺序的结合特异性降低。特异顺序在大的基因组中随机存在于不同位点的几率增加。改进特异性的方法之一是使用多个调节蛋白。由几个不同蛋白的结合顺序框定正确的转录起点使其随机性可以忽略不记。如果使用几种负调节蛋白则不能改善其特异性，因为一个阻遏蛋白的结合就足以阻遏RNA聚合酶的转录。但是如果是几个正调节蛋白，它们必定各自有自己的DNA结合顺序，如果这些蛋白形成复合物，转录起始的特异性就可被改善。在一个大的基因组中正调节更简单，更有效率。如果在人体的 100 000个基因使用负调节机制，那么，每个细胞必须合成足够浓度的 100 000个不同阻遏蛋白以进行特异性结合。在正调节中，大多数基因通常处于无活性状态（即 RNA聚合酶不结合启动子）。细胞只要选择性地合成一组激活蛋白就可以激活一套细胞所需的基因的转录。 尽管有上述的原因，从酵母到人的这些真核生物中还是有一些负调节的例子。 第十五章 重组DNA技术
1．请叙述克隆一个DNA片段的基本方法。
2．何谓限制性内切酶和甲基化酶？它们的功能是什么？
3．何谓DNA克隆的载体（vector）？载体DNA应具备哪些特征？ 4．质粒（plasmids） 为什么可作为载体DNA？ 5．试比较噬菌体A和质粒作为克隆载体的优缺点。 7．请介绍农杆菌中Ti质粒的特性。
8．何谓基因文库？建立 DNA文库（基因组文库）的基本方法是什么？ 9．何谓CDNA文库？如何建立CDNA文库？ 10．何谓菌落原位杂交？ 1.
（1）选择合适的限制酶，以便定点切割靶DNA和载体DNA。
（2）选择能够进行自我复制的小分子DNA，如质粒或病毒作为载体DNA。 （3）制备所需要的DNA片段。
（4）用DNA连接酶连接载体DNA和目的基因，使它们形成重组DNA分子。
（5）选择合适的方法把重组 DNA分子送入细胞，由细胞提供 DNA复制的环境条件。另外，还要选择一种能够检测重组DNA是否进入细胞的方法，即筛选含重组子的细胞克隆。用于完成上述步骤及有关任务的方法统称为重组DNA技术。
2．限制性内切酶存在于许多种细菌中。这些限制酶的功能是识别和降解外来的 DNA，而细胞本身的DNA不被切割。这是因为存在限制性内切酶的细胞中还有另一种酶即共座甲基化酶，它能识别限制性内切酶所识别的核普酸序列，并把其中的某些碱基进行甲基化修饰，因而避免了限制酶对自身DNA的破坏；外来的DNA分子，因为没有甲基化标记，作为异己而易被限制酶切割。
3．要使外源DNA片段能在宿主细胞内复制，必须有特殊“载体” 的帮助。通过它，外源 DNA可进入受体细胞扩增。这种使外源 DNA得到克隆扩增的 DNA称为载体 DNA。载体DNA应具备下列特征：
（1）是宿主细胞本来就具有的或是宿主细胞完全可接受的 DNA分子；
（2）它的分子量要尽量小，它不仅能在宿主细胞内独立地进行复制，而且也能复制它所连接的DNA分子； （3）载体DNA经限制酶切割后，仍不失自我复制能力；
（4）载体DNA应携带可供筛选的遗传标记，在外源DNA插入后，这些特征可作为重组DNA的选择标记。如 SC101质粒含有抗四环素的基因，质粒上有一个 ECORI酶切位点，酶切后不破坏抗四环素基因，结合外源 DNA后也不会损伤该基因。 在原核生物的DNA重组中常用的载体是质粒和噬菌体。酵母和动物病毒等常用作真核生物克隆的载体。
4．质粒是细菌染色体外的遗传因子，通常为双链环状的DNA。质粒能自主地进行复制，这 样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定的遗传。在天然条件下，一些质粒可通过类似于细菌接合的方式从一宿主转移到另一宿主细胞，这类质粒称为游离体。但这类质粒不适合作载体，需经改造使之不在细胞间转移，以使危险基因不致被传递。通过“转化”，质粒进入细胞后，使受体菌获得新的遗传特性。因为质粒上往往携带一些特殊的基因，如有 些质粒上有产生大肠杆菌素的基因，使大肠杆菌可以分泌大肠杆菌素，以杀死外来的细菌。有些质粒上有“钝化”抗生素如四环素的基因，使大肠杆菌在含有四环素的培养基上仍能生长，此称为抗药性。这些特性可用于筛选获得重组子的克隆。 5．质粒作载体简单易行。质粒作为载体尽管有许多优点，但所携带的外源 DNA只限于10kb以内的小分子 DNA片段。因细菌转化的效率随着质粒分子量的增加而下降。一些较大的DNA片段可用噬菌体人作为载体进行克隆。使用噬菌体入作为克隆载体是基于它的三个重要的特性。
（1）λ噬菌体颗粒中的 DNA是线状双链DNA，该病毒基因组中约 1／3的 DNA是非必须的，因此可以用外来的DNA替换之。
（2）λ噬菌体可允许插入的 DNA长达 23kb，一旦人噬菌体的 DNA片段和大小合适的外源 DNA片段相连接，所产生的重组 DNA分子在加入含有完成噬菌体包装所需的所有蛋白质的细菌细胞抽提物时，它们能被组装成噬菌体颗粒。此过程叫做体外包装，这样获得的噬菌体就能把重组DNA分子送入细胞。
（3）λ噬菌体侵染大肠杆菌，可以在宿主细胞内增殖，并使细胞裂解放出约100个噬菌体颗粒，使外源DNA得以克隆和扩增。 7．多数农杆菌中含有一个大的质粒（约200kb）叫做Ti质粒，Ti质粒上有一段DNA，称为 T－DNA（transferred DNA，约 23kb）；当农杆菌和一个植物细胞接触时，它所含的质 粒中的T－DNA片段在质粒转化入植物细胞中时，能整合到植物核染色体的随机位点，并导致冠瘿瘤的形成。T－DNA以外的一个约35kb的区域内含有毒性基因（Vir）。该毒性基因的产物对T－DNA的转移及整合是必需的。这个T－DNA编码的酶改变植物的代谢物，形成两种对细菌很重要的化合物。第一类是植物的生长激素植物生长素和细胞分裂素。它们刺激植物细胞生长，转化植物细胞形成冠瘿。第二类化合物叫冠瘿氨基酸或冠瘿瘦碱，它是一类细菌的食物来源，其化学本质是一类氨基酸衍生物。如蟑鱼碱是精氨酸与丙酮酸缩合而成的化合物，农杆碱是谷氨酸的二环糖衍生物。冠瘿氨基酸在肿瘤内被大量合成并分泌到周围，它们仅能由细菌用Ti质粒编码的酶所代谢。
把T－DNA转入植物基因组的细菌系统能用来转入重组DNA。
8．DNA文库（DNA library）是由一个基因组产生的所有 DNA片段克隆的总称。简单地 说，就是把某一基因组DNA切割成成千上万个片段，把这些片段全部克隆。于是，这些DNA片段的全部克隆含有一个生物体的全部遗传信息。就像人类知识都储存在图书馆中一样。建立DNA文库的基本方法是： （1）纯化载体DNA；
（2）用相同的限制性内切酶分别切割载体DNA和基因组DNA，并经蔗糖密度梯度离心纯化切割后的基因组DNA片段，去掉太大或过小的片段；
（3）将纯化的基因组 DNA片段与切开的载体 DNA混合并连接，产生的“连接混合物”用于转化细菌细胞或包装成噬菌体颗粒。让重组噬菌体转染细菌细胞，这样便产生了含有不同重组DNA分子的一群细菌细胞或噬菌体。从理论上讲，几乎所有的这个基因组的DNA都可能存在于这个DNA文库中。以这种方法建立的“DNA图书馆” 叫做“基因组文库”。每个细菌细胞生长成一个菌落或称一个“克隆”；每个“克隆” 中的细胞含有相同的重组DNA分子。在噬菌体构成的“文库” 中，每个重组噬菌体产生一个噬菌斑，即琼脂培养基上细菌“草坪” 中细胞被溶解产生的半透明的环斑。在一个噬菌斑中的所有重组噬菌体都是相同的。
9．由于许多真核生物基因是内含子和外显子的嵌合体，为了建立更专门更特异的文库以克 隆那些在某个器官或组织的细胞中才能表达的基因，可从这些器官或组织的细胞中分离纯化出mRNA，经反转录酶催化产生与之互补的DNA，即 cDNA，将这些cDNA插入载体进行克隆，产生的克隆群体叫做cDNA文库。
如胰岛素原的制备，从胰腺组织细胞中分离出胰岛素原的mRNA，在反转录酶的作用下，产生胰岛素原的cDNA；将胰岛素原的 cDNA插入质粒构成一个重组质粒，经转化，重组质粒可进入大肠杆菌细胞，胰岛素原便可在细菌细胞中合成。
10．一般的方法是把一张硝酸纤维膜平展均匀地压在含有许多经“转化”处理的受体茵茵落的培养皿表面，这些菌落含有不同的重组DNA分子。于是每个菌落的一些细胞粘到了硝酸纤维膜上，形成一个复印版。将硝酸纤维膜用碱处理，以裂解粘附在上面的细胞并把DNA变性，这些变性单链DNA仍被吸附在硝酸纤维膜上原菌落所在的位置，然后用带有放射性的互补DN A或RN A片段作为探针处理膜，探针将和有互补顺序的DNA退人杂交。这样就可用放射自显影的方法找到能和探针杂交的菌落，也就找到了含有目的DNA顺序的克隆。