实验四 RNA的提取及其纯度检测
实验目的： 了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及
电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。
实验原理
Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。
在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。
实验内容
材料 小鼠新鲜肝 试剂
总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇； 电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青），琼脂糖。
操作步骤 总RNA的提取
1小鼠肝组织的匀浆裂解
断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，震荡15秒，室温放置3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。 2 RNA的沉淀
将离心的上清转移到新的离心管中，按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放置10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。 3 RNA的洗涤与溶解
吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水（50μl）溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-70℃保存备用。 结果
在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S
和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。
紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度
总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值，每一样品重复3次。
如果A260/A280比值均在2.0以上（2.0－2.2之间），说明RNA的纯度很好。
注意事项
创造无Rnase的环境
注意以下几点，以防止Rnase污染样品，保证分离到全长mRNA：
1、 手和空气中的细菌霉菌是主要的Rnase污染源。为防止污染，应在超净台上无菌操作。这些试剂都要反复使用，所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。 2、最好用一次性使用塑料制品提RNA，这些制品常是无RNase的，无须灭活RNase。 3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前应除RNase。玻璃制品应于200℃烘烤过夜，塑料制品用前用0.1N NaOH，1mM EDTA作彻底冲洗，再用无RNase水冲洗。 4、用户自备的溶液应用0.05TPC处理过夜，再高压灭菌30分钟以出去痕量DEPC。
实验五 逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段
实验目的 了解RT-PCR的原理，掌握 RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。 实验原理
PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有
效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA，mRNA 翻译后编码产生蛋白质。真核生物的mRNA 的3端有多个腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴，因此可以与Oligo dT结合，在反转录的作用下形成cDNA。再通过基因的特异引物PCR扩增得到基因的特异片段，此方法称为2步法。也可以根据已知基因的序列设计引物，以基因的特异引物进行逆转录，得到特异基因的cDNA，以此为摸板PCR扩增得到特异基因片段，由于此法转录和PCR扩增在同一反应管中进行，转录和扩增的引物相同，因此称为一步法。
One Step RT-PCR的原理
一步法的优点：
实验内容
材料 小鼠新鲜肝
试剂 总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham) 无水乙醇，已丙醇；
RT-PCR试剂盒逆ReverTra Ace -α- 购自日本东洋纺公司
本试剂盒采用了两步反应法（Two Step法）完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在不同反应体系中进行，先由反转录酶从RNA反转录为cDNA，再由cDNA扩增目的片段。
操作步骤
1总RNA的提取根据上次实验总RNA的提取进行。 2 按下列组成配制RT-PCR反应液。
① 在0.2ml 离心管中加入
RNase Free H2O 5.5μl OligodT 5 μl RNA 1.5μl Total 12μl
② 70℃水浴5min,迅速在冰上冷却2min 。简短离心后收集反应液，加入以下组分：
5×RT Buffer 4μl dNTP 2μl RNase inhibitor 1μl Rever Tra Ace 1μl
此时，配置成20μl体系。 3 逆转录反应为42℃ 60min , 95℃ 5min。 4 PCR反应 ① 在PCR仪上设置好程序：
94℃ 4min，变性 94℃ 15sec，56℃ 25sec，72℃ 30sec 40个循环 72℃ 10min，4℃ 保存 ② 根据GenBank中小鼠actin的基因序列，设计正向引物和反向引物分别为：
5'ACCTCTATGCCAACACAGTG3，′5′GGACTCATCGTACTCCTGCT3'，引物合成后用无菌水稀释成20μM。 ③ 在0.2ml 离心管中按下列顺序加样，建立50μl体系。
ddH2O 15μl 10×Buffer 2.5μl MgSO4 1.5μl dNTP 2μl Primer1 0.5μl Primer2 0.5μl cDNA 2μl HS Taq 1μl Total 25μl
④ 混匀，短暂离心。 ⑤ 将离心管放在PCR仪上进行PCR反应。
5电泳检测
首先按照下列步骤制胶： ① 称取1.0g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液。 ② 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。 ③ 待凝胶冷至60℃左右，加入核酸染料，核酸染料的终浓度为0.05μl/ml。 ④ 将琼脂糖溶液倒入模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5㎝，室温下15-30min后，琼脂糖溶液完全凝固。 ⑤ 将模具放入电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中。 ⑥ 反应结束后，取PCR反应液 (5 –8ul) 进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
思考题 一步法和两步法RT-PCR的有何差别，在实际应用上体现在哪些方面？