过氧化氢酶
酶工程作业，姓名：刘勇，学号：20114081115
1.酶性质
过氧化氢酶( Hydrogen peroxidase) 又称触酶( Catalase, CAT ) , 是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶, 是以过氧化氢为底物, 通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气。EC1.11.1.6，分子量在240000左右，相对分子量一般为200-340kD,最适温度0-10℃，最适pH为7.6，过氧化氢酶分子结构中含有Fe3+，卟啉环，一个分子酶蛋白中含有4个铁原子，Km=20mmol/L,在0一10℃范围内酶活性没有明显的变化,酶活性达到最大,当温度超过20℃以后,酶活性随温度的升高而明显下降。酶浓度在0.05-0.2ug/ml范围内,酶活性随酶浓度的增加而逐渐增高,呈较好的量效关系,当酶浓度增加到.04ug/ml时,酶活性趋于平值状态,这可能与底物耗尽有关。
2.CAT 的主要来源
迄今为止的研究表明, 几乎所有需氧微生物中都存在CAT , 动物肝脏、红细胞、植物叶绿体等也含有大量CAT。过氧化氢酶属于好氧型微生物,产生于所有的好氧生物细胞。好氧生物体通过产生酶来保护自己,以抵御在呼吸过程中由生物化学反应产生的H2O2。H2O2是新陈代谢的副产品,但对生物体有毒性,因此生物体为了抵御H2O2的产生,自身产生过氧化氢酶来分解H2O2,即2H2O2→O2+2H2O。过氧化氢酶分解H2O2是细胞正常新陈代谢的一部分,但如果这些微生物受到外界H2O2的激发,则会加快过氧化氢酶的产生,即使非常少量的微生物也会产生大量的过氧化氢酶。
CAT普遍存在于植物组织与细胞中,是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一,其活性可间接反应种子活力的大小,与粮食品质之间也存在着一定的相关关系,是一项重要的衡量谷物品质的指标。
3.细胞破碎方法
研磨法
4.提取方法
研磨法
酸溶液提取法
5.粗分离方法
离心分离法
6.精分离方法
6.1高锰酸钾滴定法 6.2层析法
1999 年, 巴西生物学家利用血清蛋白和过氧化氢酶共纯化, 从人胎盘发生溶血的血液
中提纯过氧化氢酶, 并应用染料亲和层析法纯化了过氧化氢酶。林少琴等将新鲜贻贝肉匀浆抽提液经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FF 柱层析纯化，得到过氧化氢酶。田荟琳以猪血为原料，采用SephadexG-100 层析和PEG 6000 分子筛层析法纯化了过氧化氢酶
7.活性纯度检测方法
7.1比色法（紫外吸收法） 7.2色谱法
7.3滴定法（碘化钾滴定法，高锰酸钾滴定法）
滴定法是利用 H2O2与一些物质在滴定过程中发生氧化还原反应，通过颜色变化判断滴定终点，根据滴定溶液的用量，计算过氧化氢酶活性的方法。
7.3.1高锰酸钾滴定法
用一定 pH 值的缓冲液提取样品中的过氧化物酶。在提取的酶液中加入 H2O2溶液，使底物与酶发生反应，15～30 min 后加入硫酸使反应停止，用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢。
过氧化氢酶酶活计算公式为：酶活 =(V1- V2)×c- 34/2×50/20. 式中：V1——酶活动度测定时所用高锰酸钾溶液体积，mL；
V2——对照试验时所用去的高锰酸钾溶液体积，mL； c——高锰酸钾溶液的浓度，mol/L； 34——H2O2的浓度，mol/L。
利用高锰酸钾进行滴定分析，该方法费时，且受外加底物浓度、催化反应温度、时间长短、滴定终点难控制等因素影响，尤其对pH值十分敏感，因此在测试过程中，影响因素产生干扰所造成的误差会掩盖研究对象间的差异。
7.3.2碘化钾滴定法
用一定 pH 值的磷酸缓冲液对样品进行过氧化物酶的提取。在提取的酶液中加入过氧化氢和氢氧化钠，使酶与底物发生反应，一段时间后加入硫酸使反应停止；利用过氧化氢、KI 和钼酸铵在一定条件下反应析出单质碘的性质，在反应液中加入淀粉、KI和钼酸铵，用硫代硫酸钠溶液滴定剩余H2O2至蓝色消失。碘量滴定法重现性差，误差也大。 过氧化氢酶酶活计算公式为：
酶活 =100×293×[c×(a- b)+lg（a/b）]/10×m×5. 式中：293——被消耗的过氧化氢的换算系数；
a——滴定样品用去的硫代硫酸钠溶液的体积，mL； b——滴定空白样品用去的硫代硫酸钠溶液的体积，mL c——硫代硫酸钠的浓度，mol/L； m——大米质量，g。
7.4化学发光法 7.5紫外速率直接法
7.6气量法
气量法根据过氧化氢酶具有极强的特异性，即它能使H2O2分解生成氧气，H2O2的分解速度以及氧气的生成速度主要由酶的活性来决定。在固定体积并保持一定温度的密闭系统中，过氧化氢酶特定反应条件为pH 值 6.9，温度 37 ℃，根据在一定时间内释放的氧气量，能够判断酶的活性。气量法要求有 War- burg呼吸仪，从而降低了测试的普遍性，而且不能反映CAT 催化反应的过程。
过氧化氢酶酶活计算公式为：
n=V×1 298/m×t×1 000.
式中：n——酶活性单位，μg O2/(g·min)；
V——反应后系统中所产生的氧气体积，μL； m——参与反应的样品质量，g； t——反应时间，min。
7.7荧光法
荧光法基于 Fe2+和 H2O2在酸性介质中，经 Fenton反应产生羟基自由基 （·OH），·OH 与喹啉发生芳香羟基化反应产生强荧光物质羟基喹啉，反应方程为：
H2O2+Fe2+→Fe3++O-+·OH， ·OH+喹啉→羟基喹啉.
喹啉几乎不发荧光，而在碱性介质 （pH 值≥11.0） 中羟基喹啉产生强荧光，一定范围内荧光强度与H2O2含量呈线性相关。CAT 催化 H2O2分解为H2O和 O2，当 CAT存在时将 H2O2分解，使 Fenton反应受到抑制，进一步抑制羟基化反应，使得荧光强度受到削弱。由 CAT 引起的荧光强度降低程度与 CAT活性有良好的定量关系，据此建立 CAT定量分析法。
7.8分光光度法（可见分光光度碘量法、直接可见分光光度法）
分光光度法是利用 H2O2与某些物质反应生成有色物质，通过测定这些有色物质的吸光度，计算CAT的活性。
7.8.1可见分光光度碘量法
可见分光光度碘量法是利用过氧化氢、KI 和钼酸铵反应析出单质碘的性质，在反应液中加入淀粉、KI 和钼酸铵使其呈蓝色，于波长 586 nm 处测定吸光度，并计算出酶活性。
7.8.2直接可见分光光度法
直接可见分光光度法是利用 H2O2在有氧供体存在下，用过氧化物酶催化反应，氧供体即邻—联(二)茴香胺（DH2）被氧化成棕色产物，于波长 436 nm处测量吸光度，并推算出酶活性。反应方程为：
H2O2+邻 - 联(二)茴香胺→2H2O+氧化型产物。
可见，光分光光度计法 （钼酸按法） 受到的影响因素很多，包括 CAT 催化反应条件、H2O2与钼酸作用生成络合物的反应等，均会影响测定结果。
7.9紫外分光光度法（紫外分光光度碘量法、直接紫外分光光度法、酶反应热效应检测方法） 7.9.1紫外分光光度碘量法
紫外分光光度碘量法利用 I2在波长 350 nm 处有1 个吸收高峰，吸光度与 I2的含量成正比，计算生成I2的量。用 UV—120 型光度计测定样品对波长350 nm 光线的吸光度 （OD 值，用 OD350表示）。 该法重现性较好，但延续时间长，易造成反应过量，检测结果不准确，尤其是大量样品的分析过程中，工作量更大。
7.9.2直接紫外分光光度法
直接紫外分光光度法利用 H2O2在波长 294 nm处有 1 个吸收高峰，吸光度与 H2O2含量成正比来计算。用 UV—120 型光度计，测定反应开始 4 min 内，对波长 294 nm 光线的吸光度 （用 OD294表示） 的数值变化。该法测定结果的重现性最好，而且操作简便、快速。
7.9.3酶反应热效应检测方法
所有的自发反应均有发热现象，通过检测发热量并将其转换为电能，检测电压大小，用以表示酶活力的大小，可以克服检测中颜色、副产物等各种干扰因素的影响，较准确地测出酶活力。
过氧化氢酶分解H2O2为H2O 与 O2并释放能量。尝试通过测定反应过程中释放的热量，并用换能器将热量转换为电压值，用以表示酶活力大小，在完成标准曲线的制作后，利用该仪器来检测酶的活力。该法具有灵敏度高、简便、快速的特点。除温度外，可排除其他因素的干扰。
8.过氧化氢酶测定相关实验
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法
一、原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】 1、材料
小麦叶片等。 2、仪器设备
研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；
3、试剂
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取：
称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.酶活性测定
取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) S1 0.2 1.5 S2 0.2 1.5 S3 0.2 1.5 管号 蒸馏水/ml S0 1.0 S1 1.0 S2 1.0 将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算：
以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。 过氧化氢酶活性U/(g.min)=
?A240?VT
0.1?VS?t?W ?A240= AS0－
(AS1?AS2)
2 式中 AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注】 所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。 【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
高锰酸钾滴定法
一、原理
过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料
小麦叶片
（二）仪器设备
1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。 （三）试剂：
1. 10%H2SO4。
2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液。
3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液 取KMnO（3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 4AR）草酸溶液标定。
4. 取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。 5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。 三、实验步骤 （一）酶液提取
取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 （二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。 （三）、用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 四、结果计算
酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：
(A?B)? 过氧化氢酶活性（mg/(g.min)＝（A－B）×
VT?1.7VS
W?t 式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）； VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）； 1.7ml为0.1mol/L KMnO41ml相当于1.7mgH2O2。