对齐，以免漏胶。）
2、 按前面方法配10%分离胶，加入AP后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪分次吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入4 ℃冰箱保存。
2.4.6样品处理
1. 从冷冻冰箱中取出样品1号和3号，用100 μL移液枪从1号管和3号管中各取
40 μL液体，放入新的EP管，标号1、3。1号中的样品为过氧化氢处理过的大肠杆菌的膜蛋白，3号为对照组。
2. 向两个EP管中加入等体积的loading buffer（2X），放在沸水中加热10 min。 3. 加热完后，放到小型离心机中，12000 rpm离心5 min。
2.4.7 SDS-PAGE分析[24,25]
将制好的胶从4 ℃冰箱中取出，放入电泳槽，向内槽加入稀释后的电泳缓冲液，
液面至少没过内侧小玻璃板。外槽加入用过的电泳缓冲液，没过金属丝即可。
向加样孔中分梯度加入样品，从左到右分别是10 μL、8 μL、5 μL、2.5 μL，处理
过的样品和对照样品两两对应。最右边加入Marker。
盖上盖子，插上电源，刚开始电泳电压为80 V，待样品跑过浓缩胶（约30 min），
进入分离胶后，把电压改为120 V继续，直到溴酚蓝刚刚跑出胶的底部，停止电泳。
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将跑完的胶小心取出，如果太干就用自来水湿润，以防破裂。将胶放入洗干净的
培养皿中，加入考马斯亮蓝在转速为70 rpm的摇床上染色2 h。
加入脱色液放到转速为70 rpm的摇床上脱色，30 min后换一次脱色液。然后继续
脱色4小时即可看到清晰条带。如果要过夜脱色，可以向100 ml超纯水中加入1.46 g NaCl作为脱色液。
2.4.8 MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定
观察SDS-PAGE胶，用洗干净的手术刀从上样量浓度相近的两组泳道上挖取3条差异最明显的条带，然后分别切成约1mm×1mm×1mm大小的胶粒，放入两个EP管，分别标号1、2。
每管加入50 μL脱色液(50%乙腈，25 mmol/L 碳酸氢铵)，室温放置30 min；吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
抽真空离心干燥30 min左右至白色颗粒状，加入2 μL(浓度为10 ng/μL)溶于20 mmoL/L碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃吸胀1 h，吸去多余的酶液，将管子倒置，37 ℃空气浴过夜。
每个装有胶粒的EP管中加入85 %三氟乙酸，37 ℃ 1 h，将液体吸净转移至一干净的离心管中，每个蛋白质胶粒再加入8 μL 2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30℃ 1 h，吸出液体与前一次的提取液合并，抽真空离心干燥。
用2 μL 0.5％三氟乙酸充分溶解肽段立即进行MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定[26]。
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第3章 实验结果
由于不知道样品浓度，第一次上样量分别是 20 μL、15 μL、10 μL，一一对应，发现对照组的10 μL条带比较清晰，而氧化应激处理后的样品中蛋白含量比较浓，条带不清晰，故第二次重新跑SDS-PAGE电泳，调整上样量，分梯度进行，其中对照组取10 μL不变，而处理组则分梯度，分别上样量为10 μL、8 μL、5 μL、2.5 μL，重新跑电泳，结果如下（图3-1）：
。
对照 处理 对照 处理 对照 marker 处理 对照 处理 样品类型 10 10 10 8 10 2 5 10 2.5 上样量（μl）
可以明显的看到，处理组与10 μL对照组样品中的蛋白含量接近的是5 μL与 8μL 这两组，因此重新调整上样量，对照组样品上样量全取9 μL，氧化应激处理过的样品，分别取6 μL、5 μL、4 μL、3 μL、2 μL。电泳结果如下（图3-2）：
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图3-1
处理 对照 处理 对照 处理 0 对照 处理 处理 样品类型 6 9 5 9 4 9 3 2 上样量（μl）
图3-2
从上述胶中可以明显发现，处理组 5 μL样品中所含的 蛋白与对照组9 μL样品所含蛋白量差不多，故这两条带上 挖取差异最明显的2个条带，编号1、2，如图3-3所示， 切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的胶粒，放入装有超纯水的 EP管中。
每管加入50 μL脱色液室温放置30 min；吸去脱色液， 重复以上步骤脱色至胶块无色透明。抽真空离心干燥30 min左右至白色颗粒状，加入2 μL溶于碳酸氢铵的胰蛋白 酶，4℃吸胀1 h，吸去多余的酶液，将管子倒置，37 ℃空 气浴过夜。
每个装有胶粒的EP管中加入85%三氟乙酸，37 ℃ 1 h， 将液体吸净转移至一干净的离心管中，每个蛋白质胶粒再加 入8 μL 2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30℃ 1 h，吸出液体与前一
图3-3 1 2 次的提取液合并，抽真空离心干燥。用2 μL 0.5％三氟乙酸充分溶解肽段立即进行
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MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定，得到如下两个图谱：图3-4为1号条带图谱，图3-5为2号条带图谱。 Band 1 Mass (m/z) 图3-3 图3-4（Band 1）
图3-5（Band 2）
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