通过查阅数据库，比对鉴定得到两种蛋白分别是麦芽糖孔蛋白(Maltoporin
precursor)、外膜蛋白OmpA(Outer membrane protein A precursor)，如下表3-1。
表3-1 质谱鉴定结果
Accession No. gi|125964|sp|P02943.1|LAMB_ECOL gi|71159605|sp|P0A910.1|OMPA_ECOL Pep. Count Protein Protein Score Score C. I. % 191 100 Band Protein Name Maltoporin precursor (Maltose-inducible porin) (Lambda receptor protein) Outer membrane protein A precursor (Outer membrane protein II*)
MW 1 49880.6 6 2 37177.7 8 426 100
17
第4章 讨论
4.1 过氧化氢的浓度
由于H2O2具有杀菌作用，掌握好H2O2加入的浓度和反应时间是一个难点。所以第一次培养大肠杆菌时，加入孵育的浓度为0.8 mmol/L、1 mmol/L的过氧化氢，与对照组一起孵育1小时，然后再提取膜蛋白，做一个SDS-PAGE电泳，条带差异较小，调整过氧化氢浓度，重新培养大肠杆菌，这一次分别加入8 mmol/L、20 mmol/L的过氧化氢孵育，提取膜蛋白，跑SDS-PAGE电泳，发现20 mmol/L处理的样品膜蛋白的条带与8 mmol/L处理和对照组的具有明显的差别，而8 mmol/L处理和对照组样品的条带基本一样，由于这次样品不多，第三次培养细菌，就分两组，一组20 mmol/L过氧化氢处理，另一组不处理做对照，孵育完后提取膜蛋白，保存样品。
4.2质谱结果分析
蛋白质功能分析：
1号条带为麦芽糖孔蛋白，它参与麦芽糖和麦芽糊精的过膜运输，具有摄取麦芽糖
和麦芽糊精的功能。同时它也能做几个噬菌体（包括lambda）的受体，缺乏膜孔蛋白，可抵抗某些噬菌体及兰刚菌素的侵害，对细菌而言，具有进化意义[27]。
2号条带为外膜蛋白OmpA，该蛋白能通过产生大肠杆菌素K和大肠杆菌素L来保
持共轭多聚体的稳定。它可以当做一个T型噬菌体的受体，也可以作为低渗透（允许小分子渗透过膜）的孔蛋白[28-30]。
由于经过氧化氢孵育的样品中麦芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA的表达量明显下降
了，而这两种蛋白都属于通道蛋白。这说明大肠杆菌在有过氧化氢存在的环境中，为了适应新的环境，减少过氧化氢的毒害作用，菌体内部的麦芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA表达量下降，关闭了膜上的小分子通道，从而减少了过氧化氢进入菌体内部，降低了过氧化氢对菌体的影响。通过这个实验，我们初步阐明了细菌抗氧化应激应答的机制。
18
4.3 前景展望
通过上述实验结果可以知道，细菌抵抗宿主的产生的活性氧的杀菌作用主要是依靠减少膜孔蛋白的编码，关闭膜上小分子通道，从而降低了菌体内的活性氧浓度，减少了活性氧对细胞的毒害作用，使细菌适应具有活性氧的环境，通过本实验，初步阐明了大肠杆菌抗氧化应激的原理，同时为进一步的实验提供了研究方向。
19
参考文献
[1] Danchenko SC, Hart M, Beger R. COmpArative proteomics of Staphylococcus aureus and the
response to reactive oxygen species[J]．FASEB J, 2006, 20:LB66．
[2] Weber H，Engelmann S, Becher D, et a1. Oxidative stress triggers thiol oxidation in the
glyceraldehydes-3-phosphate dehydro-genase of staphylococcus aureus[J]．Mol Microbiol, 2004，52(1) :133-140．
[3] Throup JP，Zappacosta F，Lunsford RD，et al．The srhSR gene pair from Staphy1ococcus aureus：
genomic and proteomic approaches to the identification and characterization of gene function[J]．Biochemistry, 2001, 40(34) :10392-10401．
[4] 游运辉. 胃癌及慢性胃炎幽门螺杆菌的蛋白质组学研究[J]. 中南大学学报(医学版), 2008,
33(5): 384-389
[5] Mostertz J，Scharf C, Hecker M, et al. Transcriptome and proteome analysis of Bacillus subtilis
gene expression in response to superoxide and peroxide stress[J]. Microbiology, 2004, 150(pt 2)：497
[6] Topanurak S，Sinchaikul S，Phutrakul S，et al.Proteomics viewed on stress response of thermophilic
bacterium Bacillus stearothermophilus TLS33[J]. Proteomics, 2005, 5(14) :3722
[7] Svensater G，Sjogreen B，Hamilton IR．Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the
induction of general and stress-specific proteins[J]．Microbiology, 2000, 146(Pt 1): 107
[8] Okano S, Shibata Y, Shiroza T, et al. Proteomics-based analysis of a counter-oxidative stress
system in Porphyromonas gingivalis[J]. Proteomics. 2006, 6(1):251
[9] 胡丽萍, 沈岩．双向凝胶电泳技术、蛋白质组与基础和临床医学[J]. 国外医学分子生物学分
册, 2001, 23(2): 118-121．
[10] Lopez-Campistrous A，Semchuk P，Burke L，et a1．Localization，aB．uotation, and cOmpArison
of the eseheriehia colik 12 proteome under two statesof growth．Md Cell Proteomies, 2005, 4：1205-1209．
[11] Zeng R，Ruan HQ, Jiang XS, et a1. Proteomie analysis of SAPS associated comnavims using
two-dimensional liquid ehromatographymass speetrometry and orle-dimensional sodium dodeeyl sulfate-polyacrylamide gel elec·tmphoresis followed by mass speetmemtrie analysis．J Proteome Res, 2004, 3:549-555．
[12] 陈阳,徐维明．蛋白质组学技术在幽门螺杆菌研究中的应用[J]．World Chin J Digestol, 2005 20
January,15, 13(2): 243-245．
[13] 张爱玲, 王兴龙, 等．蛋白质组学技术及其在病原微生物研究中的应用[J]．中国预防兽医学
报, 2008, 30(5):408-410
[14] fields s. Proteomics in genomeland(J]. Science,2001, 291:1221-1224
[15] O’Farrell P H. High resolution two-dimensional eletrophoresis ofproteins[J]. J BioChem, 1975，
250:4007-4021．
[16] Kathryn S Lilley,David B Friedman.Difference gel electrophoresis DIGE[J]．Proteomics，2006，3：
347-353．
[17] Tonge R，Shaw J,Middleton B，et al．Validation and diferentialgel offluorescence electropho-resis
technology[J]．Proteomics，2001:377-396．
[18] Gao BB，Stuart L，Feener EP．Label-free quantitative analysis of 1 D-PAGE LC/MS/MS proteome：
Application on angiotensin Ⅱ stimulated smooth muscle cells secretome．Mol Cell Proteomics 2008；7(12): 2399-2409
[19] Chaudhri M，Scarabel M ，Aitken A． Mammalian and yeast l4-3-3 isoforms form distinct patterns
of dimers in vivo ．Biochem Biophys Res Commun 2003；300(3):679-685
[20] 李建善.活性氧自由基在动物机体内的生物学作用[J].动物医学进展,2006,27(10):33-36. [21] 那宏坤. 差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质[J]. 分析化学,
2009,37(7):1019-1024
[22] Grog A,Obermaier C,Boguth G,et al.The current state of two-dimensional electrophoresiswith
immobilized pH gradient[J]．Electrophoresis,2000,21(6):1037-1053
[23] 杨天南. 微生物的培养与分离[J]. 新高考：物理化学生物，5010,3:43-45
[24] Regula JT，Uebede B，Boguth G，et al. Towards a two-dimensional proteome map of Mycoplasma
pneumoniae[J]．Electrophoresis, 2000, 21(17):3765
[25] 韦莉，杨兵. 禽致病性大肠杆菌外膜蛋白SDS-PAGE分析[J]．北京农业科学，1999,17(1)：43-45 [26] 廖翔，应天翼等. 考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进[J].生物技术通讯，2003，
14(6):509-511
[27] Lisen Kullman, Transport of Maltodextrins through Maltoporin: A Single-Channel Study[J].
Biophysical Journal, 2002, 83(2): 803-812
[28] 陆庆泉，刘吉山．禽致病性大肠杆菌外膜蛋白研究现状与进展[J]．中国兽药杂志，2002，36(7)：
40-43
21
[29] 赵香汝，杨汉春．禽病原性E.coli 6种血清型分离株外膜蛋白型的研究[J]．中国兽医杂志，1999，
25(9):3-5．
[30] 高崧，刘秀梵，张如宽等．我国部分地区禽源性大肠杆菌的外膜蛋白型[J]．微生物学报，1999，
39(3):226-232．
22