电镜技术
电镜室现有设备
1、H-7500型透射电镜，购于2004年，最大点分辨率为0.24nm,有效放大倍数达60万倍。 2、S-3000N型扫描电镜，购于2004年，有效放大倍数达30万倍。
3、辅助设备：Tome-Power XL超薄切片机，零界点干燥仪，离子溅射仪等。 电镜的发展历程： 1924年，法国Broglie提出了“电磁波与光一样，具有波动性“的假说，并计算出电磁波长为0.005nm. 1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或 磁场中偏转聚焦的现象。 1928—1931年间，德国的Ruska成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜，放大倍数为1200倍。 20世纪50年代初到60年代末期，电镜分辨本领得到大 幅度提高，达到1nm左右，到80年代的点分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高压透射电镜（1000KV)的点分辨率可高达0.001nm。 电镜基本类型
一、透射式电子显微镜 二、扫描式电子显微镜 三、根据电子枪发射方式不同，可分为热阴极电子枪和场发射电子枪。 四、其他（冷冻或低温电子显微镜、高压或超高压电子显微镜、分析电镜、扫描隧道显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、原子力显微镜、环境扫描电子显微镜等约几十种不同类型电镜） 主要内容
1、电镜的基本原理和结构简介2、电镜的样品制备（透射电镜和扫描电镜3、电镜的应用简介
光学显微镜与电子显微镜在工作原理上的比较： 光学显微镜是利用玻璃制作的透镜对光进行折射，将一物点发出不同角度的光线最终会聚成一个像点。 电子显微镜是利用电场或磁场（电磁透镜）折射高速电子束流，达到成像目的。 透射电子显微镜的原理和结构
光的衍射现象： 由于光具有波动性，当光线通过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的圆环。
显微镜的分辨本领：显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径 D（分辨能力）大小来决定的即
D=
当光的波长为 λ= 500nm = 0.5μm 物体与物镜所形成夹角的半数 α<90o 介质折射率 （油） = 1.5 央亮斑的半径 D = 200nm = 0.2μm
1、人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点。油镜最小能分辨0.2 μm的两点。 则油镜理论最大放大能力为： 0.2mm / 0.2 μm = 1000（倍）
2、假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,则其理论放大倍数为：0.2mm / 0.1nm = 2x106
3、H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm,则其理论放大倍数为：0.2mm / 0.24nm = 0.83x106。而其有效放大倍数为 0.6x106
瑞利准则：光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领
的 瑞利准则。
什么是电磁透镜？
由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用，因而可以得到电子光学像。我们称这种具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜为电磁透镜（electron magnetic lenses）。由于电磁透镜磁场非均匀分布，物、像点在磁场之外，电子在磁场中既受到轴向分量的作用，又受到径向分量的作用，使平行于轴进入磁场的电子束可获得聚焦。
电磁波长的计算 ： 根据公式λ= (n m) 如 V = 50000 v， 则 λ = 0.005 nm= 0.000005μm 代入公式 D= 则 D=0.000002μm
电镜的像差和畸变
①球差：电子束光源通过透镜受到偏转，通过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出的射线，到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大，则靠近光轴的射线和远离光轴的射线，受到电磁场的作用就会不同，这些射线在光轴上会聚的位置不同，结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。
②像散：由于透镜的磁场强度在纵向或横向上不同，以致纵向与横向上的射线聚焦于光轴的位置也有上有下，两者共同形成一个最小模糊像。
③色差：由于电磁波长随加速电压而变化，当加速电压不稳定时，电子束波长就可变异，因而发生类似的像差。
④畸变：由于离轴较远处的径向磁场的作用力强，使放大倍数随物点离轴的距离而变化，进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和S形畸变等， 反差
? 人的眼睛在区分物体时，主要根据物体不同部位或物体之间的光强度与波长的差别，这些差别构成了物体的反衬度，又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。 ? 由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同，疏密度不同，它们散射电子的能力也各不相同，散射电子能力强的地方，显现为暗像；相反，散射能力弱的地方，显现为亮像。因此，在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定反差的荧光图像。
1、照明系统：
1） 电子枪：可分为热阴极和场发射两种。前者主要有钨丝(W)和六硼化镧(LaB6)；后者又分热场发射和冷场发射，一般采用的是单晶钨，但现在有采用六硼化镧(LaB6)的趋势。 聚光镜
2） 样品室 3） 成象系统：物镜 中间镜 投影镜 4） 观察记录系统：观察室 照相 CCD数字成像系统 5）辅助系统
扫描电子显微镜工作原理及结构
通过极细的电子束扫描射击标本表面而激发出二次电子或产生反射电子，并通过一定途径被接收到阴极射线管而成像。
扫描电镜由两个主要部分组成： 探查系统和显示系统 一、探查系统：由电子枪、电磁透镜组成。
二、显示系统：电子检测器，闪烁器，光电倍增器以及显示屏组成
二、 透射电子显微镜样品制备 (1) 超薄切片技术
电子束的穿透能力一般较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须把样品切成厚度为 10—1000nm 的薄片。我们把切片厚度小于100nm的薄片称为超薄切片，是电镜观察生物样品常用方法之一，常用厚度为50-100nm。
透射电镜样品制备(包埋块制作）操作流程： 取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 oC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37oC烘箱过夜；纯包埋液45oC烘箱2小时）——包埋聚合（45oC烘箱3小时，65oC烘箱48小时）
取材要点及注意事项
快：取材时间在1—2分钟以内完成；
小：体积大小在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形； 冷：固定液温度在4摄氏度左右
准：取材部位要准确，尽量取材于所要 观察的部位。
取材方法介绍：
1、器官组织 取材法：主要针对活体器官组织的取材如肾、肝、肺等活检组织
2、游离细胞收集法：主要针对培养细胞及游离细胞如血细胞、脱落细胞等。常用方法有血浆或血清预包埋法。
常见脏器的取材简介 睾丸组织取材方法
１、灌注固定 2、注射固定3、浸泡固定
4、位置选择：要观察生精细胞或支持细胞，取材于睾丸的睾丸网部位，大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅，就在白膜下附近。如果要观察成熟精子，最好取材于附睾的尾部，此处精子已基本成熟，而且精子密度最高。 肝组织取材法 1、灌注固定法
2、浸泡固定法： 动物经麻醉后打开腹腔，暴露出肝脏，选取一片肝小叶（如左小叶），先用细线扎紧小叶间连接部位防止出血，接着用手术剪剪下这片小叶组织放在滴有固定液的蜡板上进行修块，切成1立方毫米大小即可。 脑组织取材法
1、脑组织灌注固定（4%多聚甲醛溶液）
２、取材位置选择：如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞，建议取材于脑组织白质部分，此处有髓神经纤维相对较多，胶质细胞比较丰富；如要研究神经元以及血脑屏障结构，建议取材于脑皮质的灰质部分。
３、定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组织的矢状面）作为切面方向，这样可以很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构的变化，突触以及毛细血管的结构也比较容易见到。
肺组织取材法 １、灌注固定
2 、浸泡固定： 载玻片挤压法：将组织放在载玻片上，并将固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压。
3、位置选择：如果以研究支气管粘膜或研究肺动脉为主的（这里指肺内的支气管），尽量取材于靠近肺门部位。如果主要研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等，建议取材于肺叶靠近胸膜一侧或者肺尖部。 肾组织取材法
１、灌注固定或浸泡固定（主要是肾穿刺活检）
２、位置选择：根据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意的是，一要取材位置选择在肾的上极，二要准确判定皮质与髓质的位置，如果是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾最外层组织取下来即可，这里一般都会有肾小球存在。一般要求切长条形。 胃肠道取材法
剖开胃肠道腔，暴露出粘膜面，用PBS或生理盐水浸洗内腔，尽量清洗干净，但注意保护好粘膜面以免损伤，然后剪一段组织进行修块。
具体做法如下：沿着胃肠道纵轴和横轴各切几条长约2毫米，宽约1毫米的长条形组织，尽量包括粘膜全层结构，以直接浸泡固定方法为宜，注意保护粘膜层细胞免受人为损伤。各实验组选取部位尽量在相同部位，以利实验比较。 骨组织取材方法
? 取小块骨片（1～2mm大小），先用2.5%戊二醛固定2小时，磷酸缓冲液漂洗2次，再将骨片
浸入脱钙液进行脱钙处理，视脱钙效果而定脱钙时间，如用EDTA脱钙液，大约3天时间，主要视组织块是否变得柔软，通常用细针刺脱钙骨片是否容易刺穿来判断脱钙效果。 ? 软骨组织一般直接固定，不需要脱钙处理。 皮肤组织取材方法
皮肤组织一般观察表皮细胞及部分固有层结构，取材以长条形为主，长约1.5mm,横径在0.5mm-1.0mm,包括表皮全层细胞及部分固有层（依据上文定向取材图示处理），表皮是复层鳞状上皮层，无血管分布。真皮部分位于表皮深面，主要由胶原纤维和弹性纤维交织构成，并含有从表皮陷入的毛发和腺体，以及从深层来的血管、淋巴管、神经及其末梢，一般不需要定向取材，但要注意位置的准确。
外周神经纤维的取材方法
脊椎动物的外周神经系统包括由脑发出的脑神经和由脊髓按节段性排列发出的脊神经。按所联系的器官不同，可分为躯体和内脏两大类，每一类又可按照传导兴奋的方向不同而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时，应先分离掉包裹神经的神经外衣，再分离出所要研究的神经。如果神经纤维直径在1mm以内，可直接切成1.5mm长条形即可，如果直径较大，则一分为二，同样切成长条形。需要注意的是，在包埋的时候必须定向包埋，纵横方向都要包埋。 肌肉的取材方法
每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官，有丰富的血管、淋巴管分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进行随意运动。肌肉具有一定的弹性，当外界刺激较激烈的情况下，肌肉往往出现痉挛现象，因此，切取肌肉组织后应先浸泡在生理盐水或磷酸缓冲液中，等肌肉恢复自然常态后再取材，纵横方向都要取，以长条形为主，大小约1*1*1立方毫米，然后浸入固定液内进行固定，需要注意的是，在取心肌的时候应取在心尖部位，在包埋的时候必须定向包埋。 胰腺的取材方法
胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。胰腺一般观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管细胞，胰岛主要分布在胰尾部位，胰体部位较少，腺泡及导管基本存在于胰体内，容易观察。组织可以直接浸入固
定液内固定。值得注意的是，由于胰腺腺泡内酶原颗粒较丰富，容易引起细胞自溶，取材时要尽量快速取材以免细胞自溶影响结果 肿瘤组织取材方法
肿瘤的生长位置几乎遍布全身，肿瘤组织主要观察肿瘤细胞的组织来源、细胞类型、分化程度以及与周围组织的关系等内容。电镜标本的取材应多位置取材，包括肿瘤的实体内部、生长发生部位、与周围正常组织的交界部位以及癌旁组织。各部位均要取若干个组织块进行固定，这样才能观察的比较全面，尤其怀疑是恶性肿瘤的组织。大小约1mm*1mm*1mm,不能过大。 游离细胞取材法
– 血浆凝集法：将抗凝全血离心分层（2000转/每分钟，10—20分钟），用毛细吸管沿着管壁轻
轻的将上清夜吸取（不要破坏白细胞层），接着用吸管吸取固定液，并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定，然后把它放在4℃冰箱内保存。
– 血浆（血清）混合法：如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成悬液放置于离心
管内（最好是玻璃的），离心成团（1000～3000转/分钟，10分钟，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右，离心，再弃去多余的固定液，然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀，离心成团，去上清液（留少许），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入，尽量避免团块分散
双重固定法：
1、固定目的是尽量保持细胞生活时的形态结构以及减少细胞的死后变化。 2、前固定一般采用2.5%戊二醛溶液固定，后固定采用1% 锇酸溶液固定
3、常用固定剂：2.5%戊二醛、1% 锇酸、4%多聚甲醛溶液、福尔马林、高锰酸钾等，有时还用戊二醛-多聚甲醛混合固定液固定。
几种化学固定方式：
1．组织块固定：切割小块浸入固定液中的方式。 2．游离细胞的固定：有离心法和悬浮制备法。
3. 原位固定法：结扎相应血管，在脏器表面切割“井”字型，然后直接在该表面上滴加固定液进行固定。
4. 灌注固定法：目前比较广泛采用，效果较好。
漂洗
目的是彻底洗净戊二醛固定液的残余，防止其与锇酸起化学反应而降低固定效果。
常用漂洗液为0.1M的磷酸缓冲液（PBS）和二甲砷酸钠缓冲液（注意有毒性）。 块染 就是对组织块进行1%醋酸双氧铀整块染色。 时间为1—2小时。 脱水（酒精或丙酮） 梯度脱水：70% 丙酮15分钟，80% 丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮１0分钟(二次)。 关键在于纯丙酮脱水！
浸泡：使某种适宜的液体介质（包埋剂）渗入组织块取代脱水剂。
包埋：使浸入的介质（环氧树脂包埋剂）经高温处理后聚合为固体，将组织块包埋其中， 利于超薄切片。 常用包埋剂：Epon-812环氧树脂、DDSA、 MNA以及加速剂DMP-30等。 特别注意：操作过程中要严防包埋剂吸潮! 包埋剂的理想性质
理想的包埋剂应具有以下性质：