(1)．粘度低，容易渗入组织； (2)．聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小； (3)．有良好的切割性能； (4)．能耐受电子束轰击，高温下不变形；
(5)．对细胞成分抽提少，微细结构保存良好；(6)．在电镜的高倍放大下，本身不显示任何结构； (7)．材料来源丰富、易得，价格低廉，对人体无害
超微病理标本微波快速制备流程：（了解）
取材（按常规要求方法）——3%戊二醛固定后经微波高火照射20秒,室温继续固定20分钟——1%磷酸缓冲液漂洗4次，每次5分钟，微波中火照射20秒——1%锇酸微波中火照射10秒，室温继续固定20分钟——丙酮50%、70%、80%、90%脱水，微波中火照射20秒，室温继续脱水2分钟。100%丙酮脱水3次，每次微波中火照射20秒，室温3分钟——丙酮：包埋剂=1：1浸透，微波中火照射20秒，室温继续浸透5分钟——丙酮：包埋剂=1：3浸透，微波中火照射20秒，室温继续浸透5分钟，2次——纯包埋剂微波中火照射20秒，室温10分钟——常规包埋——聚合：70℃ 20分钟，95℃ 30分钟，110℃ 60分钟——半薄切片光镜定位——超薄切片——醋酸铀微波中火照射染色30秒，双蒸馏水漂洗——枸橼酸铅微波中火照射染色20秒，双蒸馏水漂洗——45℃烘箱干燥——电镜观察。
注意：高火：600——800W ；中火：约400W。
超薄切片流程
1、切片前的准备：铜网清洗（用丙酮和乙醇浸洗）
2、支持膜制备：常用Formvar膜（聚乙烯醇缩甲醛）， 由氯仿配置，浓度为0.5%。 3、玻璃刀制备：专用制刀机制作。
4、半薄切片光镜定位（需要了解组织细胞结构）。
5、超薄切片：专用超薄切片机切片，需要培训。厚度在 50—100 nm 之间较为合适。 6、染色：柠檬酸铅-醋酸铀双重染色法。如果前面 已经进行块染的，只要铅染即可。
电镜观察、拍片、记录等
? 首先，观察人员要熟悉电镜的基本操作程序以及所要观察材料的相关知识。熟悉CCD数字成像系统的基本操作程序。
? 其次，做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容。。 ? 最后，做好各种资料的整理、备案工作。
扫描电镜样品制备流程
取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——脱水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟，换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟）——干燥（零界点干燥或冷冻干燥）——镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）
负染技术
观察颗粒状生物材料的外部形状常用的染色方法。
用重金属盐沉积到样品四周，样品四周散射电子的能力就较强，因而表现为暗区；样品本身散射电子的能力较弱，则表现为亮区，这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。常用磷钨酸盐或醋酸铀溶液。
电镜酶细胞化学技术
? 电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术。酶存在的特定位置称为酶的定位。主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶，有100多种。 ? 注意：在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏
? 以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。
在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3?二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。
脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。
酶细胞化学的常规操作流程
? 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液，常用的缓冲液有二甲
砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。
? 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以 用冰冻切片机切片。 ? 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。
? 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中
孵育，孵育温度一般为37℃。
? 5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用0.1M二甲砷酸钠缓冲液
漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液要保持在4℃左右。
? 6、后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。脱水、浸透、包埋、切片同
常规超薄切片制作。
? 7、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好，可以进行铅—铀双重染色，
但必须有不染色的切片对照。
免疫电镜胶体金标记技术
? 免疫电镜胶体金标记技术也称金标法（或免疫金染色）。金标法是利用胶体金（Colloidal gold）
在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜下金颗粒密度很高，清晰可辨。
? 胶体金是金的水溶胶，主要用还原法制备。较多用的还原剂有枸橼酸钠、白磷、鞣酸、乙醇、
抗坏血酸、过氧化氢等。
枸橼酸三钠还原法
? 1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入洁净锥形瓶内煮沸。 ? 2）取1%枸橼酸三钠水溶液4ml，加入煮沸的氯化金中。
? 3）混合、搅拌、煮沸，约5分钟，溶液颜色由蓝→紫→橙红，冷却后即可。
? 此时胶体金颗粒直径约为15nm。如将枸橼酸三钠的量分别减少至1.5ml、1.0ml、0.75ml,则胶体
金颗粒直径将分别增至30、50或60nm.
胶体金标记物（金探针）的制备 1、胶体金标记蛋白质及其纯化
1）取100ml胶体金PH为7.2。
2）称取相应最适量蛋白质，于去离子水中溶解（100ul）。
3）在磁力搅拌器中将上述两液混合、静置。
4）10分钟后再加入胶体金稳定剂，如3%聚乙二醇（PEG）或5%小牛血清白蛋白（BSA）。 5）用超速离心法去除未标记蛋白质。离心速度和时间取决于金颗粒大小及蛋白质的种类。胶体金标记羊抗兔IgG，以牛血清白蛋白稳定者，先用低速离心20分钟（金颗粒20nm者用250转/分，5 nm者用4000转/分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。留取上清液，再以高速离心，4℃下离心1小时（金颗粒20nm者用14000转/分，5 nm者用60000转/分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。弃上清液，留取沉淀物备用。
6）将沉淀物用0.02M PBS(pH8.2,内含1%BSA或PEG)悬浮、清净，高速离心，重复三次，最后将胶体金标记物溶于原液体积1/10的TBS中，即可应用。
免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色。 包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面抗原的标记。因此，现今普遍采用包埋后染色。
电镜包埋后胶体金染色法
? 1）超薄切片80 nm左右置于无支持膜的镍网上。
? 2）至1～10%H2O2液中处理10分钟～1小时不等，越硬需要H2O2浓度越高越利于抗体进入。
? 3）双蒸馏水洗3次，每次5～10分钟。
? 4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）液滴上， 室温30～60分钟，或1：5，5分钟。 ? 5）PBS漂洗3分钟，PBS（内含1%牛血清白蛋白）PH8.2中，5分钟。
? 6）加适量稀释的胶体金标记抗体液（1：30～1：100），淡红色为适宜稀释液，4℃20小时或室温10分钟～2小时。
? 7）双蒸馏水洗3次，每次3分钟。
? 8）如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复2～7步骤。 ? 9）5%醋酸铀染色，5分钟，双蒸馏水洗涤，3次。 ? 10）枸橼酸铅染色，5分钟，双蒸馏水充分洗涤。 ? 11）干燥后电镜观察。
? 结果：阳性抗原部位聚集金颗粒。
标本回顾性研究——
石蜡块做超薄切片技术
1、定位取材：根据光镜显示，切取需要的部位，大小约1mm3的若干小块。
2、溶蜡：先在37℃烘箱内熔蜡4小时，再二甲苯37℃烘箱内浸泡8—12h，期间要震荡摇换一次。 3、水化：用100%（1小时）、90%、80%、70%丙酮进行水化（各15分钟） ，直到完全水化。 4、漂洗：用缓冲液漂洗（0.1M磷酸缓冲液或二甲砷酸 钠缓冲液)两次，各15分钟。 5、固定：用2.5%戊二醛固定2小时以上，其余步骤同常规电镜样品制作处理。
电镜应用简介
1、生命科学上的应用：几乎包括所有的学科研究领域都已经用 到或即将用到电镜技术。比如动物或植物细胞的超微结构（包
括细胞核、细胞质及其细胞器等内容物、细胞间的连接等）的形态观察，通过对比观察，对动植物形态在超微结构水平上进行分类、分型，以探讨遗传、变异及病理病因的机理或机制，为生命科学的基础研究所不可或缺的研究手段。
利用常规电镜技术和特殊电镜技术如免疫电镜技术、电镜酶细胞化学技术、电镜原位杂交技术等
可以进行细胞细胞超微结构及超微病理分析，以及细胞内抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。 2、在临床诊断中的应用：主要应用于临床活检组织的超薄切片观察分析。通过活检组织的细胞形态变化及其相互间的关系，根据其形态变化规律和特点进行分析诊断，为临床病理诊断或辅助诊断提供较可靠的形态依据。
在鉴别肿瘤组织来源、分化程度、浸润情况等，以及疾病的病理分型或分期和疾病的早期病理改变等方面，电镜比光镜具有一定的优势。病原微生物（如细菌、病毒、支原体、囊虫等）的形态观察或鉴别也是电镜观察的强项。
3、材料上的应用：包括材料的内、外部结构或形貌观察，颗粒形态、大小测量、排列分布等情况。如果应用能谱分析仪器，就可以检测材料的元素组成、含量、分布等情况。
4、其他领域上的研究：如矿物质、考古等。
电镜技术练习题
1、透射电镜标本取材的基本要求并简要说明。
2、什么是瑞利准则？电镜与光镜在原理上有何相似和不同之处？ 3、简述透射电镜及扫描电镜样品制作流程 4、常用的化学固定方法有哪些？
5、普通透射电镜包括那些结构？请简要叙述。 6、简述电镜在生命科学中的应用
7、简述电镜的球差和畸变及其形成原因。 8、简述电磁透镜及其聚焦原理
9、什么是反差？简述电镜荧光图像反差形成的原因。 10、游离细胞取材方法有哪些?并简述其处理方法。 11、简述超薄切片流程并简要说明。
12、简述石蜡块做超薄切片的样品制作流程 13、简述负染技术及其应用。