(图1 BCA(bicinchnimic acid)是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。)
1.4 生物质谱法
多肽和蛋白质的分子量可用MALDI/MS(基质辅助激光解吸离子化质谱法)或ESI/MS(电喷雾离子化质谱法)直接测定,用质谱法测定蛋白质的分子量简便,快速灵敏、准确。
2 核酸类药物的主要分析方法
2.1 紫外分光光度法测定RNA与DNA含量
核酸类药物多含碱基,具有共轭双键结构,对子外具有特征吸收,RNA和DNA对紫外的特征吸收处于260nm处。在260nm波长下,每1ml含1ugRNA溶液的光吸收值为0.022,每1ml含1ugDNA溶液的光吸收值为0.020。故测定样品在260nm处的吸收值即可测定样品中核酸含量,但应避免核苷酸与蛋白质杂质干扰。
2.2 地衣酚显色法测定RNA含量
核糖核酸与浓盐酸在100℃共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚)反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂,反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20~250μ g范围内,光吸收与RNA的浓度成正比。地衣酚反应特异性较差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA含量,再计算出RNA含量 。
2.3 二苯胺法测定DNA含量
DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解,产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸,后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物,在595nm处有最大吸收,且DNA在40µg ~400µg范围内时,吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。
(图2 ω-羟基-γ-酮基戊醛)