生物学 酵母表达
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S ri P a ma e t a o
r a Vo No 2 2 0 tat h r cu i l u n l l1 . 0 7 c J 9的表达水平。一般情况下，源基因整合的拷贝数愈高，白外蛋 表达量愈大，表达鼠表皮生长因子 ( G时，如 mE F)多拷贝产生非常高的表达量。目前提高整合拷贝数的方法主要有： 1通 ()过不同的转化方法提高拷贝数。 . atr的转化方法有电激 P psoi s法、生质体法、化锂法等，中以原生质法转化使细胞群原氯其中产生多拷贝转化子频率相对较高 .若使用 G4 8检测拷但 1贝数，配合电激法转化的效果更好 . 2在体外载体上多次则 ()插入目的基因片段 .这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有但限 . 3将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高 ()重复的基因片段，过同源重组而达到高拷贝整合的目的。 通由于 r A在酵母基因组中有 10 2 0重复单元，以这是 DN 0~ 0个所一
Mu菌中分离 Mu自发突变体来使外源蛋白的表达量增 t t加。Ivt g n公司提供了 K 7 n io e r M 1和 G 1 5两种宿主菌株， S1 KM 7转化子是 Mu型， GS 1化子主要是 Mu表 1 t表而 1 5转 t型，有一小部分是 Mu。型。哪一种表型对外源蛋白的表也 t表达量更高，每一种蛋白而言是不确定的，此在 Mu+株对因 t菌中表达水平较低时，以尝试用 Mu型来表达。在 G l5可 t表 S l
中表达较低的可以尝试用 KM 7表达。 1来5优化发酵条件 5 1通气量、度、H、醇含量和培养时间等发酵条件 .温 p甲发酵条件主要包括通气量、度、H、醇含量和培养时间温 p甲.
等。养基的 p值和温度，于获得大量蛋白并具有生物活培 H对性非常重要。常，母的生长条件为 2~ 3℃,H是 30通酵 8 0 p .~
种提高拷贝的理想方式。。目前要快速高效地筛选高拷贝 的转化子，过 P R法检测拷贝数既方便又快捷，外还可通 C另
8 0而对于在甲醇诱导启动子 AO的调控下表达的 ., xlP c c,5和 p . sl 4 3℃
a H3 5是最适的表达条件。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，足的氧气是毕赤酵充母高效表达所必需的。 lt F等的实验显示，量相同的菌 Vial le等
通过提高 G4 8的浓度来筛选高拷贝转化子。小量摇瓶试验 1是筛选转化子简便而有效的方法，是由于摇瓶培养中巴斯但德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确反映发酵罐中的情况，之成为令人头疼的问题。主要问题是在摇瓶培养使
液接种到相同体积的培养基中，于采用摇瓶形状不同，碱由胆酯酶的表达水平可以相差几千倍，氧饱和度却相差不到两但倍，即使氧气饱和度相同，达水平仍旧相差甚远㈣。有报道表认为，果用发酵罐进行培养，源蛋白的表达水平要比普通如外摇瓶发酵高出 1~ 1 0“。中科院上海生化所用毕赤酵母 0 0倍 表达的胰岛素前体，摇瓶发酵时为 4 mg· _,在 I L在 0 L。而 O的发酵罐中的表达水平是 2 0 5 mg·。永志 (0 0用毕赤 L-。郭 20)
中，养液的 p值无法控制，养物的通气不充分及无法控培 H培制添加碳源的最适速率，是为了避免对每一个表达菌株进但
行繁琐的发酵罐培养条件实验，需摸索表达菌株的摇瓶培仍养。在发展了一种 S M摇瓶技术 (h kn eami e rr现 C sa e cr— c mba— m
l l k,种摇瓶技术培养条件比普通摇瓶发酵更接近于发 ea )这 fs酵罐发酵，以使外源蛋白的表达比普通摇瓶发酵提高 2 6可 .~
1倍， 0因而对重组转化子的筛选更为有效“。然而， 并非所
酵母表达系统表达重组胰岛素原，发现相同体积的培养液通过发酵罐，源蛋白的产量比摇瓶中的产量提高 5 1倍。外~ 0主要原因是普通摇瓶发酵的通气不理想，响了菌体的高密度影生长及表达。源也是影响高水平表达的重要因素。赤酵母碳毕表达培养基常用的碳源是甘油，甘油对 A但 OX启动子有抑制作用。T op用山梨糖醇代替甘油作为碳源，果生物质 h re结量下降，外源蛋白的表达有
所提高。。油的添加量也影响但甘到外源蛋白的表达，油添加的最适水平应该是在利用甲醇甘
有高拷贝的转化子都能产生高的表达量，别在分泌表达时，特这可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。有时有意增加
拷贝数对表达量并没有什么效果，利等在用巴斯德毕赤酵辛母表达人血管抑素时发现，贝数超过 l菌株表达血管抑拷的素的量要高于单拷贝的菌株，而拷贝数超过 2以后，然重组蛋白的表达量并没有明显的增长极少数情况下，贝数的增在拷
加反而会导致蛋白产量的下降。巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合，由于 P x在甲醇诱导下的但 Ao l强启动性以及整合后都很稳定，以即使单拷贝也能获得较所高的产量。因此基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高
诱导时能够被消耗殆尽。用甲醇诱导外源蛋白表达，在诱利则导期间往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发。两用
步法 (用甘油培养使细胞达到一定的浓度，加甲醇诱导 )先再 和联合生长培养的方法 (rwt—soi e,早期加人甲醇 go hasc td在 a诱导 )诱导外源蛋白的表达都有成功的报道，在一般两步来现法来诱导外源蛋白的表达。而 O ah (9 8的研究证明 h si 1 9 ) go t—s cae诱导甲醇酵母高水平表达外源基因的很 rw has i d是 o t好方法，比普通方法高出 1㈣。几年也有用甘油、油一 0倍近甘甲醇、醇的的培养方式，可以改善酵母菌培养的代谢条甲这件，短诱导期，得更高的蛋白产出率，即使加入很低浓缩获但度的甘油也会抑制外源蛋白的合成，在诱导期，而只加入甲醇并随时监测发酵液中甲醇的浓度，获得更高的产量。“” 可 。。
表达菌株的筛选应以表达蛋白量为唯一标准。4载体和宿主的选择
用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白时有多种表达载体可供选择。有胞内表达的，有分泌表达的；有组成性表达的，既又既 又有诱导性表达的；泌表达
又有多种表达信号肽可以选择。分
可以根据具体情况选择高表达载体。外源蛋白的表达也受宿主菌遗传特性和生长特性等的影响，比如说，果外源蛋白对如蛋白酶敏感，用蛋白酶缺陷的受体菌可减弱蛋白酶的作用。使转化子的表型对外源蛋白的表达也有影响，般说来，白胞一蛋
内表达时，先考虑用 Mu。型；于分泌表达， t优 t表对 Mu和 M u+可使用。在高生物量的发酵中， t生长更快，之 t都 Mu较 M u+于提高外源蛋白的表达量更有效。有时 M u菌株虽 t对 t 然在诱导阶段生长缓慢，外源蛋白的表达反而更高，有利但更于蛋白的正确折叠， P P I表达在 Mu。株中较高也 如 eT的 t菌可以在不改变现有表达载体及宿主菌的前提下，过从通
以甲醇作为诱导剂不但可以诱导 AOX启动子驱动外源蛋白 的表达，可以诱导蛋白酶的表达，也因此甲醇添加量对外源蛋白的表达可以产生影响，时，同由于培养条件和转化子表型不同，加甲醇的量也有所不同。添甲醇含量可根据甲醇检测器或气相色谱来测，甲醇检测器测量时会受乙醇和其它简单碳氢有机物的影响，气相色谱测量得出的数据较准确。导时间用诱·5‘