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流式细胞仪入门
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二OOO年四月
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目 录
前言
第1章 综述
第2章 液流系统
第3章 散射光信号及荧光信号
3.1 散射光信号
3.2 荧光信号
第4章 光电系统
4.1 光平台
4.2 光学滤片
4.3 信号探测器
4.4 阀值
第5章 数据分析
5.1 数据采集及显示
5.2 设门
5.3 细胞亚群的数据分析
5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析
第6章 分选
6.1 分选
第7章 激光器及光路校正
7.1 激光器的工作原理
7.2 光路校正
第8章 答案
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序 论
学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScanTM，FACSortTM，FACSCaliburTM，和BD LSR）与大型机（FACS VantageTM，FACSVantageTM SE， 和FACStarPLUSTM）之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
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第一章 综述
流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：
液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。
电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。
在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。
单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
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图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲
习题：综述
1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？
2 大多数流式细胞仪使用何种光源？
3 流式细胞仪的三大系统是什么？
4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？
5 液流包绕细胞形成
6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？ 7 由粒子激发的光由
8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对 错） 9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对 错）
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第二章 液流系统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。
因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。
流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：
图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦
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图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦
样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。 台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒
子或细胞在流动室内与激光相交（图2-1）。除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。
大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室
外与激光相交（图2-2）。且样本压力连续可调。
增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。
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高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间
距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多
数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。
习题：液流系统
1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？
2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？ 3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？
4 单个细胞悬液在
5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为 6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？
7 对于台式机，样本的固定压力是多少。
8 增加样本压力，也就是 9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。 10 加大流速会降低检测分辨率。（对 错）
11 定性检测时可使用高流速。（对 错）
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第三章 散射光信号和荧光信号的检测
上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。
3.1 散射光信号
粒子折射激光产生散射光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。
前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号（见图3-1）。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。
侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见图3-1）。SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。
图3-1 细胞的光散射特性
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上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。
图3-2 FSC、SSC二维散点图
习题：散射光信号
1 什么时候会发生光散射现象。
2 光散射信号与细胞的哪些特性有关。
3 与激光束方向相同的光散射称为
4 FSC与细胞的哪些特性相关？
5 与激光束方向呈90度角的光散射称为 6 SSC与细胞的和相关。
7
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3.2 荧光信号
荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。
能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。
目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光（详见第7章）。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。
图3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱
如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如FITC和PE双染
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就符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。虽然PE的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。被检测到的荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
图3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱
图3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合
对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记
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确认细胞类型（见图3-5）。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。
习题：荧光信号
1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射。 2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为 3 由荧光染料发射的波长称为
4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。
5 能够激发FITC和PE的波长是多少。
6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是 7 荧光素标记抗体用于检测
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第四章 光学系统
光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。
4.1 光平台
流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。图4-1和图4-2分别为台式机 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平台系
统。
图4-1 台式机 FACS Calibur 光平台系统
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图4-2 台式机 BD LSR光平台系统
在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。大型机的光平台系统见图4-3。
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图4-3 大型机 FACS Vantage SE 光平台系统
习题：光平台
1 光平台为 的激光器提供了一个固定平面。
2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。 3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对 错）。
4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置
是不变的。
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4.2 光学滤片
当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。光电倍增管（PMTs）检测到的荧光信号常常是很微弱的。在光电倍增管（PMTs）前设置滤片可以使相当窄的一波长范围内光通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的发射峰值。这种滤片称为带通（BP）滤片。如：FITC检测器前的滤片标志为530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者说允许通过的波长范围在515nm和545nm之间。BP 500/50则表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。
流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片（LP）和短通滤片（SP），长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。（见图4-4）。
分光器的主要作用是完成光的收发。二色性反射镜就是其中一种。560短通二色性反射镜如图4-1所示发射560nm或小于560nm的波长（如图4-1所示）。大于560nm的波长被反射。
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图 4-4 光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围
习题 ：光学滤片
1 检测器前放置滤片作用是什么。
2 带通滤片530/30发射的波长范围是 3
4 滤片允许特定波长及以上的光通过。
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4.3 光电探测器
处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压），然后到相应的通道。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。光电倍增管（PMTs）对光信号比光电二极管敏感，所以前者用于检测较弱的SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强的FSC信号。
粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先光信号或光子由光电倍增管（PMTs）或光电二极管转换成相应的电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。当粒子位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。当粒子偏离激光束时，脉冲回到基线（如图4-5所示）。
图4-5 充电脉冲的产生
充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子