No.8 林 雪等:改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析1457化处理,按文献[3]的方法计算其摩尔比.
2 结果与讨论
2.1 糖的衍生化 文献[2]用NaOH溶液对单糖进行PMP衍生化时(013mol/LNaOH,70℃),在衍生化反应结束后,用盐酸中和是一个重要的步骤.而本文用氨水代替NaOH,用PMP对糖类物质进行标记,反应后不需酸中和,而是加入纯水后,通过真空干燥除去过量的氨水,使待测样品达到中性,简化了反应步骤,5种常见单糖衍生物得到很好的分离.其结果见图1(A)
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Fig.1 HPLC2UVchromatogramsofthePMPiveiandlactosehydrolysa(A)Peaks:1.Man;2.4.()Glc;2.Gal.Mobilephase:acetate
(0=5(o∶22);flowrate:1mL/min;UVdetection:245nm.
2.2 PMP衍生化方法由于用盐酸中和NaOH时产生了大量的盐,而盐会影响MALD2MS[图2(A)],需要在进行质谱分析前进行脱盐处理.用氨水代替NaOH作溶液的另一显著的优点是无需进行样品脱盐处理便可直接进行质谱检测,这样不仅不会影响质谱检测的灵敏度[图2(B)],而且减少了样品(尤其是微量样品)的损失
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Fig.2 MALDI2MSspectraofglucose2PMPderivatives
(A)Aqueoussodiumhydroxidesolutionwasusedasthebasemedium;(B)liquidammoniasolutionwasusedasthebasemedium.
2.3 最佳衍生化条件的选择 用氨水取代NaOH作溶液,以葡萄糖为基准物质,分别探讨了衍生化反应过程中所涉及的3个主要因素,最后确定了最佳反应时间为30min,最佳反应温度为70℃,最佳摩尔比为5∶1.
2.4 衍生化产物的HPLC分离方法的建立 分别考察了衍生产物的线性关系、最小检测限以及进样精密度和衍生化方法的重复性.单糖衍生物在较宽的浓度范围内具有良好的线性关系,而且无论是进样精密度还是方法重复性的峰面积的标准偏差值均小于3%,因此,在用氨水替代NaOH溶液的PMP柱前衍生化方法适用于单糖及多糖的单糖组成分析.
2.5 多糖样品的糖组成分析 乳糖水解后经衍生化得到的HPLC图谱见图1(B),经计算可以得到葡萄糖与半乳糖的摩尔比为0197∶1,基本符合1∶1的要求,由此可见,利用本文中的衍生化方法可以进