17. 群落功能差异分析
通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后，我们可以通过16s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成，从而分析不同样本和分组之间在功能上的差异（PICRUSt Nature Biotechnology, 1-10. 8 2013）。
通过对宏基因组测序数据功能分析和对应16s预测功能分析结果的比较发现，此方法的准确性在84%-95%，对肠道微生物菌群和土壤菌群的功能分析接近95%，能非常好的反映样品中的功能基因构成。
为了能够通过16s测序数据来准确的预测出功能构成，首先需要对原始16s测序数据的种属数量进行标准化，因为不同的种属菌包含的16s拷贝数不相同。然后将16s的种属构成信息通过构建好的已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能结果。（根据属这个水平，对不同样本间的物种丰度进行显著性差异两两检验，我们这里的检验方法使用STAMP中的two-sample中T-TEST方法，Pvalue值过滤为0.05，作Extent error bar图。）
此处提供COG，KO基因预测以及KEGG代谢途径预测。用户也可自行使用我们提供的文件和软件（STAMP）对不同层级以及不同分组之间进行统计分析和制图，以及选择不同的统计方法和显著性水平。
参考文献：
Donovan H. Parks1 ,Gene W. Tyson,STAMP: statistical analysis of taxonomic
and
functional
profiles,
Bioinformatics(2014)30(21):3123-3124.doi:10.1093
18. COG构成差异分析图
图中不同颜色代表不同的分组，列出了COG构成在组间存在显著差异的功能分类以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。
19. KEGG代谢途径差异分析图
通过KEGG代谢途径的预测差异分析，我们可以了解到不同分组的样品之间在微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异，以及变化的高低。为我们了解群落样本的环境适应变化的代谢过程提供一种简便快捷的方法。
图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在第三层级的构成在组间存在显著差异的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。
本例图所显示的是第三层级的KEGG代谢途径的差异分析，也可以针对第二或第一层的分级进行分析。
20. 基因的差异分析图
除了能对大的基因功能分类和代谢途径进行预测外，我们还能提供精细的功能基因的数量和构成的预测，以及进行样本间以及组间的差异分析，并给出具有统计意义和置信区间的分析结果。
这一分析将我们对于样本群落的差异进一步深入到了每一类基因的层面。 图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在组间/样本间存在显著差异的每一个功能基因（酶）以及在各组的比例，此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。
21. 在获得标准报告后如果希望单独修改分组或对某些组之间进行显著性差异分析，可以使用STAMP软件在自己的电脑上进行数据分析。STAMP提供了丰富的统计检验方法和图形化结果的输出。
在使用STAMP之前需要首先准备需要的spf格式文件和样品分组信息表。在我们的报告中已经将KEGG和KO以及COG的结果文件后经过转换生成了适用于STAMP软件打开的spf格式文件，还有对应的分组信息表文件groupfile.txt。
以下是使用STAMP时的一些相关问题，详细的STAMP使用教程可以参考我们提供的STAMP使用教程。
1、stamp作图用的原始数据的来源？
STAMP 可以直接使用来自QIIME的biom文件和PICUST的KEGG和ko 文件，groupfile.txt文件的格式为tab-saperated value (tab键隔开的数据)
2、分组问题：导入数据之后，viewàgroup legend ,在窗口右侧会出现分组栏，根据需要进行分组。
3、Unclassiffied选项中，remain Unclassiffied reads、remove Unclassiffied reads、和use only for calculating frequency profiles 方法的区别？
remain Unclassiffied reads和use only for calculating frequency profiles方法会保留所有的数据，而remove Unclassiffied reads仅仅保留有确定分组信息的数据。
4、Statistical test 中，Welch’s t-test、t-test、white’s non-parametric t-test的区别，各自优缺点？
为了确保统计学意义和准确度和精确性，需要足够多的样本数目，t-test检验可以在最少样本数为4的时候确保高的准确度和精确性。
当两个样本之间具有相同方差的时候，用t-test更为准确，当两个样本没有相同方差，Welch’s t-test更为准确。
当样本数目少于8的时候，可以使用white’s non-parametric t-test，该计算时间较长，当样本数目过多的时候不宜使用该方法。
5、Two-group 中type: one side 和 two side 的区别？
One side 只会显示前一个group与后一个group差异的比例，而two side 两者之间的比例均会显示。
6、 STAMP在使用时首先打开了一个分析文件，如果新打开一个可能会导致显示错误？
目前版本的STAMP存在一些小问题，一次分析只能使用一个数据文件，如果要打开新的需要关闭软件后再打开。
22. 环境因子分析 RDA分析 CCA/RDA分析
基于对应分析发展的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。