一，Lipo2000转染
1,准备细胞：转染前一天，向含9mlDMEM（含血清不含抗生素）的9cm平板接入细胞，使其在转染时长到90%。转染前用DMEM（—）洗2遍后，加入9mlDMEM（不含血清不含抗生素） 2,准备混合物： ①将6ug质粒稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ②将18ul Lipo2000稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ③将①②混匀，静置20min。
3，将混合物加入平板，前后摇匀。
4,6h后给细胞换DMEM（含血清不含抗生素）。 5，继续培养8—48h，观察。 二，生物素标记
1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。 2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。
3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。 4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。 5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。
6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。 7，向1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml） 8，4℃涡旋1h。
9,20000g,10min,4℃,以沉淀核酸与其他残渣。 10，把上清转入新的EP管，（这是总蛋白，T，一般情况下浓度应该在1-5mg/ml，可以用Bradford method来测定浓度，并调整全部样品至同一浓度）
11，向300ul pre-cleared sample中加入300ul含50% slurry-Avidin beads的PBS,PI孵育。（PI，蛋白酶抑制剂，的工作浓度0.1-1mM，17-174ug/ml） 12，室温涡旋1h。（使生物素和亲和素充分结合） 13，离心除去beads，将上清转移至一新离心管中。（这是位结合的蛋白质，浓度相对于总蛋白被稀释了1.5倍。）
14，向beads中加入150ul 2×Laemmli buffer来将beads上的蛋白质洗掉。（洗下来的蛋白浓度是总蛋白浓度的2倍） 三，WB
(一) 做胶
1， 将板洗干净，晾干 2， 把两个板合在一起放到模具上，板要对齐放平，板下垫胶皮垫，防止液体
渗出。
3， 配制分离胶： 1.5mm的胶，一块大约7ml
用一个小烧杯，按顺序加入，每加入一样都混匀一下，再加下一样。加入TEMED后，混匀，用枪头搅拌30s。
4， 用蓝枪头吸取配制好的分离胶，慢慢加入两板之间，从板的一角竖直加入。
加到离梳齿下缘1cm处。
5， 用蓝枪头吸取ddH2O，从两板之间的上方水平加入，直到水平面与玻璃板
持平。静置30min。（其中30%丙烯酰胺和TEMED要避光保存，10%过硫酸铵分装到EP管里）
6， 把水倒掉，将板倒过来，用纸吸干 7， 配制积层胶：方法同分离胶，注意混匀。1.5mm板每块约需3ml。 8， 用蓝枪头加积层胶，从板的一角加入，胶面与板持平。 9， 加入梳子，将梳子按下去，梳子顶部与版面持平。会有液体渗出来，注意
不要溅到身上。静置30min。
(二) 点样：把板取出放到电泳槽内，小槽内液体要灌满，大槽可以不满。 (三) 跑胶：先以60V跑30min,等样品进入分离胶后可加电压至80V。 (四) 转膜
待溴酚蓝跑出去后，停止电泳。 1， 用剪刀剪取名片大小的minipore PDVF膜，剪去一个角做标记。 2， 向两个小方盒里transfer buffer和甲醇。
① 将PDVF膜放入甲醇1min，取出放到转印滤纸上，滤纸是用transfer
buffer浸湿的。（用一个夹眉毛似的小镊子，取膜会很方便）
② 用一个塑料刀片将胶取出，除去积层胶，切角做标记。放到有transfer
buffer的方盒中。
③ PDVF膜与滤纸之间不能有气泡，将胶放到PDVF膜上，做标记的一角
对齐。保证胶与PDVF膜之间没有气泡。 ④ 盖上另一层转印滤纸。（可以多加几层）。用刮子刮一下，保证没气泡，
合起来就好了，放入转膜模具。 ⑤ 膜朝正极，胶朝负极。
(五) 封闭
1， 直接从转膜模具中拿出来，不用洗 2， 5%脱脂奶粉+1×TBST现配，将膜放入，摇床室温2h。
(六) 一抗
1， 把封闭液倒掉 2， 向5ml新的封闭液中加10ul一抗，加到盛膜的盒子里，摇床室温1-2h。 (七) 二抗
1， 将一抗液体倒掉，洗转印膜，1×TBST3次，每次10min。 2， 加二抗 3， 二抗孵育完也要洗，1×TBST3次，每次10min。 (八) 曝光
1， 取一张保鲜膜，取出PDVF膜，在纸巾上竖着碰几下，让水微微干 2， 加ECL，用枪头赶平，室温1min，最后用保鲜膜包起来，剪去周边。 3， 曝光30s，在暗室进行，底片也剪个小角，底片小角与膜小角对应。 4， 在显影液中显影，在定影液中定影，在水中清洗，晾干即可。