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4-1
11.1g鲜重的肌肉含有40单位的某种酶，其转换数为6×10min，试计算该酶在细胞内浓度（假设新鲜组
-7
织含水80%，并且全部在细胞内）。[8.33×10 mol/L]
-643-7
解：[10/（6×10)]×40÷[（1×80%）/10]=8.33×10 mol/L
3
12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相对分子质量为120×10，由6个相同亚基组成。纯酶的Vmax为2800U/mg酶。它的一个活力单位规定为：在标准测定条件下，37℃、15min内水解10μmol焦磷酸所需
-5
要的酶量。问：（1）每mg酶在每秒钟内水解多少mol 底物？[3.11×10mol]。（2）每mg酶中有多少mol-8
的活性部位（假设每个亚基上有一个活性部位）？[5×10mol活性中心]。（3）酶的转换数是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s·mol）酶活性中心]
-6-5
解：（1）2800×[（10×10）/（15×60）]=3.11×10 mol
-33-8
（2）（1×10）/（120×10）×6=5×10 mol
-5-33
（3）{（3.11×10）/[（1×10）/（120×10）]}/6=622
13.称取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2mg，若以每分钟产生1μg 酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白质量及活力单位。[0.625mg蛋白质，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白质]（3）1g酶制剂的总蛋白含量及5总活力。[0.625g，2.5×10U] 解：（1）（0.2×6.25）/（2×25/25）=0.625mg （1500/60）/（0.1×25/25）=250U （2）250/0.625=400U/mg 33 （3）[0.625/（1×25/25）]×10= 0.625×10mg=0.625g 35 [（1500/60）/（0.1×25/25）]×10=2.5×10U 14.有1g淀粉酶酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取出1ml测定淀粉酶活力，测知每5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂所含淀粉酶活力单位数？[3000U]（淀粉酶活力单位定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量称为1个活力单位） 解：（0.25×60/5）/（1/1000）=3000U 15.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据：试计算比活力、百分产量及纯化倍数。[比活力：180U/mg蛋白质，百分产量：17%，纯化倍数：9倍] 初提取液 （NH4）2SO4盐析 体积/ml 120 5 活力单位/（U/ml） 200 810 蛋白质/（mg/ml） 10 4．5 解：（1）810/4.5=180U/mg （2）810×5÷（200×120）×100%=17% （3）180÷（200/10）=9
第九章 酶促反应动力学
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提要
酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率各种因素的科学。它是以化学动力学为基础讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。化学动力学中在研究化学反应速率与反应无浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应及零级反应。研究证明，酶催化过正的第一步是生成酶-底物中间产物，Michaelis-Menten根据中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一个特征常数，以浓度为单位，Km有多种用途，通过直线作图法可以得到Km
-1
及Vmax。Kcat称为催化常数，又叫做转换数（TN值），它的单位为s，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数。酶促反应除了单底物反应外，最常见的为双底物反应，按其动力学机制分为序列反应和乒乓反应，用动力学直线作图法可以区分。
酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制3类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数Kˊm变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，Vˊmax变小；反竞争性抑制Kˊm及Vˊmax均变小。通过动力学作图可以区分这3种类型的可逆抑制作用。可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制，过度态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。研究酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。
温度、pH及激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度及最适pH，要选择合适的激活剂。在研究酶促反应速率及测定酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。
习题 1.当一酶促反应进行的速率为Vmax的80%时，在Km和[S]之间有何关系？[Km=0.25[S]] 解：根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得： 0.8Vmax=Vmax[S]/(Km+[S]) Km=0.25[S]
-2
2.过氧化氢酶的Km值为2.5×10 mol/L，当底物过氧化氢浓度为100mmol/L时，求在此浓度下，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数。[80%] -3-2-3
解：fES=[S]/（Km+[S]）=100×10/(2.5×10+100×10)=80%
3.由酶反应S→P测得如下数据：
[S]/molL 6.25×10
-5
7.50×10
-4
1.00×10
-3
1.00×10
-2
1.00×10
-5
-1
-1
-6-1
V/nmolLmin
15.0 56.25 60.0 74.9 75.0
-1-1
（1） 计算Km及Vmax。[Km：2.5×10，Vmax：75 nmolLmin]
-5-1-1
（2） 当[S]= 5×10 mol/L时，酶催化反应的速率是多少？[50.0 nmolLmin]
-5-1-1
（3） 若[S]= 5×10 mol/L时，酶的浓度增加一倍，此时V是多少？[100 nmolLmin] （4） 表中的V是根据保温10min产物生成量计算出来的，证明V是真正的初速率。 解：（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法，或由米氏方程得：
-6-6-4-4
15=Vmax·6.25×10/ (Km+6.25×10)??① 60=Vmax·10/（Km+10）??②
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由①、②得：Km=2.5×10，Vmax=75 nmolLmin
-5-5-5-1-1
（2）V=75×5×10/（2.5×10+5×10）=50.0 nmolLmin
-1-1
（3）50×2=100 nmolLmin
-9-6
（4）底物转化量：（15．0×10×10）/（6.26×10）=0.024=2.4% < 5% ，故可证明。
-5-1-1-1-4-1
5.某酶的Km为4.7×10 molL，Vmax为22μmolL min，底物浓度为2×10 molL。试计算：（1）竞
-4-1
争性抑制剂，（2）非竞争性抑制剂，（3）反竞争性抑制剂的浓度均为5×10 molL时的酶催化反映速率？
-4-1-1-1这3中情况的Ki值都是3×10 molL，（4）上述3种情况下，抑制百分数是多少？[（1）13.54μmolL min，-1-1-1-1
24%；（2）6.68μmolL min，62.5%；（3）7.57μmolL min，57.5%] 解：（1）竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])
-1-1
代入数据得：V=13.54μmolL min
i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=24%
（2）非竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))
-1-1
代入数据得：V=6.68μmolL min
i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=62.5%
（3）反竞争性抑制剂的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki))
-1-1
代入数据得：V=7.57μmolL min
i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=57.5%
6．今制得酶浓度相同、底物浓度不同的几个反应混合液，并测得反应初速率，数据见下表。请利用“Eadie-Hofstee”方程式，用图解法求出Km值及Vmax值。这种作图法与Lineweaver-Burk作图法比较
-1-1-5-1
有何优点？[Vmax=160μmolL min,Km=8.0×10 molL] [S]/molL 4.0×10
-4
2.0×10
-4
1.0×10
-5
5.0×10
-54.0×10 -52.5×10 -5
2.0×10 -4-1-5
-1
-1
V/μmolLmin
130 110 89 62 53 38 32
-1-1
解：将米氏方程改写成：V=Vmax-Km·V/[S],以V-V/[S]作图，得一直线，其纵截距为Vmax，斜率为-Km，
-1-1-5-1
由图得Vmax=160μmolLmin,Km=8.0×10 molL
优点：实验点相对集中于直线上，Km和Vmax测定值较准确。
7.对一个遵从米氏方程的酶来说，当底物浓度[S]=Km，竞争抑制剂浓度[I]=Ki时，反应的初速率是多少？[V=1/3Vmax] 解：根据米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=Ki
V= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax
-5
8.用下列表中数据确定此酶促反应：（1）无抑制剂和有抑制剂的Vmax和Km值。[无抑制剂时Km=1.1×10
-1-1-1-5-1-1-1
molL，Vmax=50μmolLmin，有抑制剂时：Km=3.1×10 molL，Vmax=50μmolLmin]（2）EI复合物
-3-1
的解理常数Ki。[Ki= 1.10×10molL]
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[S]/molL 无抑制剂 0.3×10 -50.5×10 -51.0×10 -53.0×10 -59.0×10 -5-1V/μmolLmin 有抑制剂（2.0×10 molL） 4.1 6.4 11.5 22.6 33.8 -5-1-3-1-1-110.4 14.5 22.5 33.8 40.5 解：（1）无抑制剂时：V=Vmax[S]/(Km+[S])，将表中数据代入此式可得Km=1.1×10 molL，Vmax=45.1-1-1μmolLmin 对表中数据用V对[S]作图，求Km值，可判断有抑制剂时，Km值明显增大，故该抑制剂应为竞争性抑-1-1制剂。据V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不变的性质可得，此时Vmax=45.1μmolLmin，Km=3.1-5-1-3-1×10 molL，Ki= 1.10×10molL
9．同上。
-3
10.从速率对底物浓度作图9-31中，求出下列参数（反应混合物中酶量为10μmol）。（1）Km；（2）Vmax；
-4-1-1-15-1-1
（3）kcat/Km；(4)转换数。[Km:5×10molL；Vmax:6μmolLmin；kcat/Km: 2×10 molLs；转换
-1
数:100s]
解：Vmax=kcat·[Et]=k3·[E]=k3·[ES]
-1-1
11.下面的叙述哪一个是正确的？胰凝乳蛋白酶的转换数100s，DNA聚合酶是15s。 （1） 胰凝乳蛋白酶结合底物比DNA聚合酶有更高的亲和性。 （2） 胰凝乳蛋白酶反映速率比DNA聚合酶反映速率更大。
（3） 在特别的酶浓度和饱和底物水平下胰凝乳蛋白酶反应速率比DNA聚合酶在相同条件下更低。 （4） 在饱和底物水平下，两种酶的反应速率，假若DNA聚合酶反应速率的6.7倍则与胰凝乳蛋白酶相
等。 答：（4）正确。原因：Ks=K-1/K1 为酶与底物亲和性的度量；只有在饱和底物水平下，才有Kcat=Vmax/[E]。
-6-1-1
12.今有一酶反应，它符合Michaelis-Menten动力学，其Km为1×10molL。底物浓度为0.1 molL时，
-1-1-2-1-3-1-6-1
反应初速度为0.1μmolLmin。试问：底物浓度分别为10molL、10molL和10molL时的反应初速率
-7-1-1-8-1-1
是多少？[1×10 molLmin，5×10 molLmin]
-6-1-1-1-1
解：∵Km=1×10molL，[S]=0.1molL ，∴V=Vmax=0.1μmolLmin
将题中数据代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：设[S]=xKm V=Vmax·xKm/((x+1)Km)=x/(x+1)·Vmax=1/(1+1/x)·Vmax V1=0.1 V2=0.09998 V3=1/2·Vmax=0.05
-4-1-5
13．假设2×10 molL的[I]抑制了一个酶催化反应的75%，计算这个非竞争性抑制剂的Ki？[6.66×10
-1
molL]
解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi??①
再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])??②
加入非竞争性抑制剂后：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))??③，此时Vmax变小，Km不变。
-4
由①②③得：Ki=2×10/（4·Vˊmax/ Vmax-1）
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加入抵制剂时，Vˊmax = Vmax，∴Ki=6.66×10 molL
-4-1-5-3
14.如果Km为2.9×10 molL 。Ki为2×10mol/L。在底物浓度为1.5×10mol/L时，要得到75%的抑
-4
制，需竞争性抑制剂的浓度是多少？[3.7×10mol/L]
解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi??①
再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])??②
加入竞争性抑制剂后：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki) +[S])??③，此时Vmax不变，Km变大。 由①②③得：[I]=4KmKi/Kˊm-Ki+3[S][Ki]/Kˊm
-4
加入抑制剂时，Km=Kˊm ∴[I]= 3.7×10mol/L
15.举例说明什么是Ks型和kcat型不可逆抑制剂。什么是过度态底物类似物？它属于何种类型抑制剂？
答：Ks型抑制剂根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还代有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶。因其专一性取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks比值，故这类抑制剂称不可逆Ks抑制剂。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一个带正电荷的侧链，如Lys、Arg侧链。对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶活性部位必需集团His57共价结合，引起不可逆失活。
Kcat型不可逆抑制剂具有天然底物的类似结构，其本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化。但抑制剂还有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反映基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，其专一性极高。例如β-卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶（AR）的不可逆抑制剂，属于磷酸吡哆醛类的自杀性底物。
过渡态底物类似物是化学结构类似过渡态底物（底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式）的抑制剂，属于竞争性抑制剂，如嘌呤腺苷水合形成是小牛脱氨酶反应过渡类似物。
-5
-1
第十章 酶的作用机制和酶的调节
提要
酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部位，对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。酶活性部位有6个共同特点。研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法，动力学参数测定法，X射线晶体结构分析法和定点诱变法，这些方法可互相配合以判断某个酶的活性部位。
酶是催化效率很高的生物催化剂，这是由酶分子的特殊结构所决定的。经研究与酶催化效率的有关因素有7个，即底物和酶的邻近效应与定向效应，底物的形变与诱导契合，酸碱催化，共价催化，金属离子催化，多元催化和协同效应，活性部位微环境的影响。但这些因素不是同时在一个酶中其作用，也不是一种因素在所有的酶中起作用，对于某一种酶来说，可能分别主要受一种或几种因素的影响。
研究酶催化的反应机制，始终是酶学研究的一个重点，通过大量的研究工作，已经对一些酶的作用机制有深入了解，该章对溶菌酶、胰核糖核酸酶A、羧肽酶A、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等的催化作用机制进行了详尽的讨论。
酶活性是受各种因素调节控制的，除了在第8章中已介绍的几种因素外，主要还有①别构调节，例如ATCase。②酶原的激活，如消化系统蛋白酶原的激活及凝血系统酶原的激活。③可逆共价修饰调控，如蛋
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