兰州大学 生命科学学院 发酵工程实验
谷氨酸发酵实验
摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。
关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节
引言：
了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。
了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。 了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。
还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。
原理:
谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。
谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。
谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸 、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。
在NaOH存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
L-氨基酸与茚三酮在加热下可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即λmax不同；加之显色深浅不同,反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为谷氨酸定性及定量。在pH 5～6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。
器材与试剂：
试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、蒸汽发生器、生物发酵系统、空气压缩机、分光光度计，水浴锅，电炉，18mm×180mm试管。
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：6.3g DNS和262ml 2M NaOH加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000ml，贮于棕色瓶中。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖40mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为0.4mg/ml。
标准样品的制备：谷氨酸纯品稀释溶液： 3mg/ml溶液，调节pH5. 5～6。 茚三酮试剂的制备：称取0. 5 g 茚三酮溶于100 mL丙酮中，避光。
pH 调节试剂的制备：① 2 mol/ L NaOH溶液：称取8 g NaOH 溶于100 mL 蒸馏水中；② 1 mol/ L HCl 溶液：量取36 mL 盐酸溶于64 mL蒸馏水中。
步骤:
斜面种子的制备（教师制备） 一级种子培养
一级种的培养目的在于制备大量高活性的菌体，培养基配方如下：葡萄糖 2.5％；尿素 0.5％；硫酸镁 0.04％；磷酸氢二钾 0.1％；玉米浆3%；硫酸亚铁 2ppm；硫酸锰 2ppm。
1000mL三角瓶中装250mL培养基，每组3瓶，0.1MPa灭菌30分钟，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。 30～32℃摇床培养12小时，如用旋转式摇床，转速为170～190转/分；往复摇床，冲程7.6cm，频率为97次/分。
一级种子质量标准：
种龄：12小时；pH：6.4+0.1；ΔOD（560nm光密度净增值）>0.5 RG（残糖）0.5％以下。 二级种子培养
二级种子的培养目的是制备和发酵罐体积及培养条件相称的高活性菌体。1000ml 三角瓶装300ml培养基，每组3瓶，0.1Mpa灭菌10分钟，冷却后接种，摇床培养7～8小时。
培养基配方：葡萄糖 2.5％；尿素 0.34％；磷酸氢二钾 0.16％； 糖蜜 1.16％；硫酸镁 0.043％；消泡剂0.01%；pH 7.0
二级菌种质量标准：种龄7～8小时；pH7.2 ；ΔOD560>0.5；无菌检查 阴性；噬菌体检查 阴性。
学习发酵罐的构造并进行消毒 1．准备阶段
配料：按工艺要求配制发酵培养基，10升发酵罐定容6升，实际配料时，定容
到4升，另40％体积为蒸汽冷凝水和种子液预留。
尿素配成40％浓度，装在1000mL瓶中，每一瓶装800mL。分消备用。 消泡剂配成1%浓度，分消备用。
培养基：葡萄糖 13％；硫酸镁 0.06％；磷酸氢二钾 0.1%；糖蜜0.3％；硫酸锰、
FeSO4 各2ppm；氢氧化钾 0.04％；玉米粉 0.125％；消泡剂 0.5%。调整pH为7.0。
2.空气过滤器及空气管路的消毒 （1） 关闭空气阀F11（蓝）；打开F12，F2（冷凝水），慢慢打开蒸汽阀阀门F3（红）排尽
冷凝水后，F12调为微开。蒸汽出口压力应在0.12—0.14MPa之间（空气过滤器压力表显示值）。压力过低，灭菌不彻底；压力过高，仪器会损坏。
（2） 微开F13（空气/蒸汽入罐的阀门，蓝），打开F14（发酵罐出气口阀门），使蒸汽经过
空气过滤器及以后的空气管道进入发酵罐内，由出气口排出。
（3） 消毒时间一般为30分钟。到时间依次关闭蒸汽发生器，F13,F12,F2.,F3。
（4） 开启空气压缩机，调节空气减压阀，使出口压力保持在0.20—0.25MPa之间（控制器
上压力表上显示值）。注意不要使空气压缩机超压工作。
（5） 打开F11（空气入口阀），F12, F13,排去冷凝水后，再将F12, F13转为微开，吹空气
过滤器。
（6） 吹干过滤器一般需要20分钟左右（注意保持空气进口压力）。然后关闭F12,F13.。保
持空气管道及空气过滤中是正压。
**注意：蒸汽灭菌完毕，关闭蒸汽入口阀。应该在排去管道内的蒸汽后，再关闭F14。 3．空消
（1） 打开排水阀F33，排尽夹套中的水。 （2） 打开F4（蒸汽阀，红），F22（出料口阀门），排尽蒸汽管中冷凝水后，将F22转为微
开，稍开F21，微开F14。使蒸汽徐徐进入发酵罐；对发酵罐进行空消。
（3） 注意在升温过程中，关闭控制器，否则当温度设定值设定在培养温度时，会自动通冷
却水，影响升温速度，同时也浪费蒸汽。
（4） 在灭菌过程中，应当时刻注意罐压，并控制在0.11—0.12MPa 之内，请勿超压，可
通过调节阀门F4和F14来控制罐压。
（5）空消时间一般为30分钟。空消时间结束后，关闭F4 、F14 , 当罐温降至80℃以下方
可完全打开F22，排尽发酵罐内的冷凝水后即可关闭F22，F21。
（6）当蒸汽阀F4关闭后，发酵罐内的压力会迅速下降，为防止发酵罐内产生负压，必须
微开F13，并调节F14，使罐压保持在0.03—0.05MPa之间。 4．电极校正
（1）DO电极的校准：配制Na2SO3饱和溶液，可以用碘量法测定溶液饱和度，此时校准溶氧电极为0%。
（2）PH电极的校准分别用PH4.0和PH7.0的标准也来校准PH电极。
（3）打开排气阀F13，卸去罐内压力；将校检好的PH ，DO电极装入发酵罐内。 （4）加胶圈。
（5）打开罐盖上的加料口，按培养基比例加入发酵罐内（参照淀粉的液化方案）。 （6）拧紧加料口螺母（注意不要拧太紧，否则会损坏密封圈）。 5．实消
（1） 检查夹套排水阀F33是否打开，夹套水是否排尽，加上防护罩。 （2） 夹套预热：关闭F31, F34, F32, 打开蒸汽阀F3 、稍开排水阀F33。
（3） 此时可开启搅拌，慢速搅动培养基；当发酵罐内的温度达到80℃左右时，打开F4，
F22，排尽蒸汽管中的冷凝水后立即关闭F22；稍开F21，使蒸汽徐徐进入发酵罐；继续升温。
（4） 此时应关闭进气阀F13，并将排气阀F15调为微开。
（5） 当发酵罐内温度达到灭菌要求温度（118℃—121℃）时，关闭阀门F3；在灭菌过程
中，应时刻注意罐压，并控制在0.1—0.11MPa之内，严禁超压。罐压的控制通过调节阀门F4和F15来实现。
（6） 注意在升温过程中不要开冷却水，否则当温度设定值设定在培养温度时，冷却水管会
自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，引起培养液浓度变化或不能达到灭菌温度。实消时间10分钟。到时间后，关闭F4、F15。 （7） 灭菌结束后，先通空气维持罐压再冷却。通冷却水进行冷却，操作如下：打开冷却水
阀F31，进行手动冷却状态；或调整温度设定值，按冷却键至自动状态；此时起即进
入控温状态。 （8） 当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa
时，必须间隙开启进气阀F13，让空气进入发酵罐内，并保持内压力在0.03 —0.05MPa之间。
（9） 当罐内温度降至70℃，可稍开进气阀F13和调节排气阀F15，调节通气量，慢速搅
动培养基，加快冷却时间；同时使罐压保持在0.03—0.05MPa之间。
（10）加初尿：发酵液冷却至40℃左右时，通过蠕动泵加第一次尿素，添加量
为0.8～1.0％。
（11）取部分未培养的培养液备用。 6．接种
将前次实验制备的二级种接入发酵罐。接种时，先缓慢降低罐压，关闭进排气阀，在接种口上绕上酒精棉点燃，用钳子逐步打开接种阀，将菌种液倒入发酵罐内，盖上接种阀，旋紧。
DO电极的校准：在温度，PH，转速均已稳定在发酵所需值时校准，100%。 7．发酵过程的控制
（1）发酵过程的温度控制：谷氨酸发酵0～12小时为长菌期，最适温度在30～32℃，发酵12小时后，进入产酸期，控制34～36℃。由于发酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过高引起发酵迟缓。
（2）发酵过程pH控制：发酵过程中产物的积累导致pH的下降，而氮源的流加（氨水、尿素）导致pH的升高，发酵中，当pH降到7.0左右时，应及时流加氮源。长菌期（0～12小时）控制pH在6.8～7.0；产酸期（12小时以后）控制pH在7.2左右；控制pH的手段主要有：①控制风量。②控制流加氮源。 放罐：残糖在1％以下且糖耗缓慢（<0.15％/h）或残糖<0.5％后，及时放罐。 葡萄糖标准曲线制作
取18mm×180mm试管，按下表加入0.4mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。 在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用冰浴迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品中还原糖的测定
取18mm×180mm试管，分别按下表加入试剂：在发酵罐中小心取样，然后4000rpm离心5分钟除去菌体细胞 ，稀释200倍，再进行测定。
加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用冰浴迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。 谷氨酸标准曲线制作
取试管，分别加入配制好的谷氨酸纯品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml，补水至3ml。随后每只试管中加入0. 5 mL茚三酮试剂，塞上PVC 胶塞。摇匀管内溶液，置于试管架中，将试管架迅速置于80 ℃水浴锅中加热15min，期间切勿将试管架拿出。然后快速取出到时的试管，再将试管架插入冰浴锅中，冷却5min。到时间后，混匀，以蒸馏水为空白对照，测出各浓度标准样品OD569值。 谷氨酸发酵液预处理