业化生产，即微生物商品产品，其中包括保健类食品、化妆品、功能性的饮料是主打商品。在1990年，实验研究人员不断地从真菌、酵母、霉菌和藻类中找了出许多可以产特种脂肪酸的菌株，研究特种油脂的热情开始澎湃，这些就为之后的微生物油脂的工业化生产打下了重要基石。
微生物油脂的研究我国在始于20世纪中期，主要是酵母菌、霉菌发酵生产，但是真正的研究报道在90年代才比较大量地出现，这证明我国这段时间的研究进展是比较慢的。而在此期间的我国主要放在功能性油脂的开发生产。20世纪80年代，上海的一所微生物研究所已经能够较好地提取含亚麻酸的油脂，含量达到8%[10]。20世纪90年代南开大学生物系发现深黄被孢霉，经紫外诱变处理后在10L发酵罐中发酵生产亚麻酸，达到了9.44%的亚麻酸含量，并且油脂得率高达29.3%[11],同样是90年代，富含棕榈油酸的酵母菌被罗玉萍等人分离出来，这个菌种的棕榈油酸高达总脂含量的50.4%。然后就有后续的李永红、赵宗保等通过对培养基组分和优化培养条件，有76.1%的油脂提取率，这是一个特别大的进步，现在国内的油脂微生物研究也开始飞快进行，我国研究人员对微生物油脂的研究也是一个非常热烈的阶段。
微生物油脂发展前景十分可观，它属于一种新型油脂资源[12]，现今可以看见的就有很多研究人员、研发公司致力于功能性油脂的开发，营养保健、食品和医药领域是这些菌种的主要阵地；还有在环境保护方面也有十分巨大的影响，通过优化发酵工艺，利用各个行业的一些废弃物作为培养原料，利用诱变、定向进化、细胞融合等现代生物技术手段对现有的菌种进行改良，在净化垃圾、保护环境的同时又增值产出，提升经济效益[13];发酵生产微生物油脂还可以利用木质纤维素为碳源，经一系列的转化生产生物柴油等等。
1.3 圆红冬孢酵母研究进展
现在，我们对圆红冬抱酵母的培养发酵产脂特性己经有了一些初步的了解，很多国内外研究人员也致力于该酵母的研究。有采用单因子实验对筛选的一些产油量较高的圆红东孢酵母植株进行培育[14]；圆红冬孢酵母的油脂组成成分主要是长链脂肪酸，在保健方面很引人注目，亚麻酸（ALA）在一定条件下能在人体转换成剧透调节机理功能的其他多不饱和脂肪酸。现在已经有研究表明，一些这类的菌株已经能使油脂的积累达到自身干重的55%，主要运用的是二阶段培养法；彭枫[15]用甘蔗渣水解液发酵生产微生物油脂（甘蔗渣水经活性炭脱毒）可以让圆红冬孢酵母油脂含量有32.99%；周稳稳[16]发酵培养生产微生物油脂使用的原料是酒精废水，也可以使圆红冬孢酵母菌体油脂含量有31.9%之多；驯化后的菌株能达到40%的油脂含量。由此看来，圆红冬抱酵母进行发酵培育是能够利用多种碳源的[17]，在对不饱和脂肪酸需求量巨大的现代社会，可以说研究出适合工业化生产的方法的话，那可以遇见的未来是非常璀璨的[18]。
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1.4本论文的研究目的、意义和研究内容 1.4.1研究目的及意义
本论文的研究是期望找出圆红冬孢酵母高产油培养条件，为以后圆红冬孢酵母的深层次加工研究、以及产物综合利用打下牢固的根基。
1.4.2研究内容
(1) 圆红冬孢酵母菌体特征； (2) 圆红冬孢酵母的生长曲线；
(3) 圆红冬孢酵母产油提取方法对比； (4) 圆红冬孢酵母主要影响因素产油量。
2 材料与方法 2.1材料 2.１.1试验菌种
试验所用菌种为圆红冬抱酵母菌为兴海楼实验室提供。于４℃冰箱中保存在YEPD斜面培养基。
2.1.2 主要试剂
主要试剂 酵母提取粉 琼脂粉 氯化钠 无水葡萄糖 硫酸镁 硫酸铵 磷酸二氢钾 无水乙醇 丙三醇 苯酚 苏丹黑 尼罗红 脱氧胆酸钠 硫酸链霉素
规格 AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR
厂家
广东环凯微生物科技有限公司 广州市齐云生物技术有限公司 西泷化工股份有限公司 国药集团化学试剂有限公司 广州化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 广州化学试剂厂 西泷化工股份有限公司 广东光华科技股份有限公司 广东光华科技股份有限公司 SIGMA-ALDRICH SIGMA-ALDRICH
北京奥博星生物科技有限公司 广州市齐云生物技术有限公司
2.1.3主要仪器
主要仪器名称规格与型号 XW-80A漩涡混合器
生产厂家
上海精科实业有限公司
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AK-1200电子天平
LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器
HZQ-F280全温震荡培养箱 洁净工作台（SW-CJ-2FD) ycd-el259冰箱
中韩合资科威电子仪器有限公司 上海申安医疗器械厂 金坛市万集实验仪器厂
上海博讯实业有限公司医疗设备厂 中科美菱有限公司
2.1.4主要溶液及培养基的配置
(1)苏丹黑B染色液的配制[19]
准确称取染料苏丹黑B ,0.50g，溶于100mL70%的乙醇水溶液中。
(2)YPD培养基，配方为(w/v):蛋白胨 2%，酵母粉 1%，葡萄糖 2%，自然 pH。固体培养基需再YPD培养基基础上加入 2.0% 的琼脂。再在115 ℃灭菌 30 min。
(3)高产油脂酵母筛选培养基(w/v): KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.15%， (NH4)2SO4
0.02%，酵母粉 0.5%，葡萄糖 4.0%。
(4)产油脂培养基 (w/v): Mg SO4·7H2O 0.15 %，KH2PO4 0.1 %，(NH4)2SO4 0.02 %，CaCl2 0.005%，FeCl3·6H2O 0.001%，·7H2O 0.002%，MnSO4·H2O 0.0002%，酵母粉0.04 %，葡萄糖 8.0 %，初始pH为4.0，115 ℃灭菌 30 min。（同时制作不同碳氮比的产油培养基，通过条件酵母提取粉的量来控制不同碳氮比 0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16%）
2.2圆红冬孢酵母培养方法 2.2.1斜面培养
先从YEPD斜面培养基上保存的圆红冬孢酵母挑取少量菌体转移到新配制的培养中，置于28℃恒温培养箱中活化培养36-48h，获得新的斜面培养菌种。
2.2.2 种子液培养液培养
通过斜面活化培养后，用接种环在无菌环境下从培养好的新鲜菌种斜面上挑取菌体接入装有50ml己灭过菌的液体种子培养基250ml三角瓶中，于28℃，180 r/min的条件下摇瓶培养24h-48h。
2.2.3 产油培养
将种子液以10%的接种量接入装有 1L产油脂培养基的3L三角瓶中进行摇瓶发酵，在28℃和180 rpm下振荡培养120h和设置6个不同碳氮比。
2.3分析方法
2.3.1圆红冬孢酵母生长曲线的测定
首先于250mL的三角锥形瓶中配制50mL YEPD液体培养基，经121℃、20min高压灭
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菌后，按照10％取从新培养的液体菌种中吸取菌种接种于其中，于28℃，180 r/min的条件下摇瓶培养，分别于0、2、4、6、8、12、14、26、29、32、35、38、52、56、58、62、80h取2ml发酵液，以灭菌后未接种菌体的培养基作空白对照，于560nm下测吸光度值，在Excel中绘制菌体生长曲线。
2.3.2菌体生物量的测定?
生物量的测定采用干重法。取圆红冬孢酵母发酵液，于3800r/min、15min条件下离心，收集菌体，用蒸馏水洗涤2-3次，再离心收集菌体置于95℃干燥箱中烘干至恒重。用电子天平测定并记录干菌体的质量，通过计算得到的菌体生物量，以每升发酵液含干菌体（g/L）表示。
菌体生物量的计算公式如下：
菌体生物量（g/L）=干菌体质量m（g）/发酵液体积v（mL）/1000
2.3.3菌体内油脂含量的测定 2.3.3.1苏丹黑B染色法
首先在洁净的载玻片上滴加1-2滴苏丹黑B染色液，然后挑取斜面少许圆红冬抱酵母菌与之混匀，再补加少量的苏丹黑B染色液，静置染色15-20min，待酒精自然挥发到干燥后，再用75%酒精清洗至载玻片透明，待酒精挥发干后用显微镜观察。经苏丹黑B染色后细胞内的油脂颗粒被染成蓝黑色，由观察到的细胞内黑色区域大小和密集程度来判断菌株产油量的多少[20]。
2.3.3.2索氏提取法
将发酵液离心，收集菌体，然后将菌体放入95℃的热烘箱中干燥至恒重，接着将干燥好的菌体用研钵磨碎（研钵需要提前进行干燥），称取一定质量的菌体粉（菌体重量在2-5g），记录为 A，用滤纸包好。将平底烧瓶烘干至恒重，常温下用电子天平称量并记录瓶重 A1。在索氏提取器中，将装有试样的滤纸包小心置于抽提管中，同时缓慢注入无水乙醚至虹吸口高度以上。待虹吸完全之后再加无水乙醚到虹吸管高的 2/3 处，将索氏提取装置置于56 ℃水浴锅中回流，抽提 8 h 左右。抽提结束后，回收乙醚，将平底烧瓶于80℃鼓风烘箱中挥发干净残留的乙醚，烘干至恒重，记录下数据 A2。则质量为 A 的菌体含有的脂肪重量为A2-A1。[21]
油脂含量（w/w）的计算： 油脂含量=(A2-A1)/A ×100%
3. 结果与讨论 3.1菌体形态特征观察
圆红冬孢酵母菌的菌落特征观察：是圆形的小菌落，直径大致在2-4mm间，菌落质地均匀，菌落表面湿润光滑、粘稠，也可以轻易挑起，菌落的边缘平滑。颜色是各个部位一致，
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都为微红色。
圆红冬孢酵母菌的显微镜菌体特征观察：短杆状，单细胞，无鞭毛。 菌落形态：
平板正面 平板背面 试管正面 显微镜形态：
大倍数：400倍 放大倍数：1000倍
图1. 圆红冬孢酵母菌落形态和细胞显微观察图
Fig. 1. Colony morphology and cell microscopic observation of Rhodosporidium toruloides
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