3.2圆红冬孢酵母的生长曲线测定
微生物生长曲线的测定有助于确定最佳的种子培养时间，缩短延滞期，提高菌体数量。配制2个50mL YEPD液体培养基，经高压灭菌后，从活化好的新鲜菌种斜面上分别挑取一环菌种接种于其中，混合均匀，另取18个无菌20mL的三角瓶，每管分装5mL上述含菌培养液，28℃ 条件下放入恒温培养箱中培养，在560nm处测定OD值，分析菌体的生长过程，绘制圆红冬抱酵母的生长曲线，确定最佳接种时间。生长曲线如图1所示。
2.52吸光度(OD)1.510.500102030405060708090时间(h) 图2 圆红冬孢酵母的生长曲线
Fig. 2 Growth curve of Rhodosporidium toruloides
延滞期、对数期、稳定期和衰亡期是各种微生物生长发育都会经历的时期，培养种子液时间不够的话，那么菌体的生长就会缓慢，不够活力；培养种子液的时间太长的话，菌体生长减速甚至进入衰亡期，使得菌体形态发生变化，后期发酵是很不利的。对数期是进行接种培养最好的时期，所以，把培养种子液对数时期的时间确定下来是至关重要的。
接种量一般来说对生长曲线的影响不大，但接种量少可能出现延迟期，本次测定是在有作比较种子液接种量为5%和10%对菌种生长曲线的影响的基础而测定的。预实验中由于5%的接种量出现了很长的延迟期，所以就直接确定了用10%的接种量来测定圆红冬孢酵母的生长曲线，之后的培养发酵实验中也用到的是10%的接种量。
从图中可以看出，圆红冬孢酵母的延滞期大概是在0-8 h，对数期大约是在8-29 h，稳定期在29-58 h，衰亡期是在58 h之后了。因为培圆红冬孢酵母养约8h后进入对数期，29h后菌体数量基本稳定，故实验选择液体培养10－24h的菌体作为种子，此时菌体生长处于对数中期，生长速度快，活力较高，有利于后续发酵。?
11
3.3苏丹黑染色法评价酵母产油量
酵母细胞油脂积累情况通过苏丹黑染色法观察判定，结果如图3所示
1d 2 d 3 d
4d 5d
图3：圆红冬孢酵母苏丹黑染色镜检结果
Fig 3: Microscopic examination with Sultan staining of Rhodosporidium toruloides
通过观察圆红冬孢酵母在产油培养基中油脂染色的程度可以大概判别酵母细胞中所含油脂量的多少。有一些研究人员根据苏丹黑染色特殊性，能够使苏丹黑显示细胞中脂类的原理，它不是一般的物理溶解现象，而是细胞化学结合的结果，但多数学者认为是细胞内的脂类物质与苏丹黑 B染料非化学性结合，但是无论是哪种结合形式，它们之间的结合程度都是相当紧密的，所以洗脱困难的问题很严重。由于每次的洗脱程度较难控制，我们也很难保证每次进行实验时的周遭环境，而且苏丹黑是酒精水溶液配制的，酒精很快会挥发，然后是的一些苏丹黑凝聚变成小黑色颗粒，加大了洗涤的难度。苏丹黑的洗脱问题一直是个难题，暂时没有特别好的方法能够将苏丹黑染液在不影响菌体的情况洗脱干净，这次实验发现最好的洗脱效果是先在75%的乙醇中浸泡10分钟，然后再换95%的乙醇再浸泡10分钟才能较好地洗掉肉眼可见的黑色斑块。
从图中可以大致看出油脂量是逐渐增多的，但是也仅仅是一个很大概地判断。由圆红冬孢酵母苏丹黑染色镜检结果可以得出的是，圆红冬孢酵母在产油培养基中培养大概5天的时间可以达到较高的产油量。据此来确定培养菌体的时间，之后采用索氏提取法对菌体内的油
12
脂进行较为精确的测定。
3.4 培养基配方中碳氮比优化
将种子液以10%的接种量接入装有1L产油脂培养基的3L三角瓶中进行摇瓶发酵，在温度为28℃、转速为180 rpm下振荡培养120h。选取的碳源为葡糖糖，氮源为酵母提取粉。然后通过改变酵母提取粉的量来调节碳氮比，葡糖糖的量为8%，酵母提取粉的量分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12%。
在发酵培养完全后，接着按照索氏提取的步骤，逐一提取圆红冬孢酵母在不同酵母粉量所产生的油脂含量的多少。其提取结果如下表1所示。
表1 在不同氮培养基中培养5天后油脂产量结果
Table 1 results of fat production in 5 days after culture in nitrogen medium 酵母提取粉的量（%） 0.00 细胞油脂含量（%） 17.23
0.02 18.36 0.04 21.91 0.06 19.75 0.08 18.56 0.10 15.34 0.12 15.12 据了解，产油量的多少很大程度取决于碳氮比，含量低的碳源含量高的氮源是比较适合菌体扩充数量的，含量高的碳源含量低的氮源是比较适合菌体积累油脂的，所以为了掌握一个菌种的最佳产油量，就需要找到碳源和氮源之间的合适比例。本实验采用一种产油培养基的方法，不在中途更换培养基。因为这样容易菌体可能被污染，增加误差的出现，所以在一些文献上的前期用低碳高氮的培养基，后期用高碳低氮的培养基的方法是由很大风险的，也难以在工业化中实现大量的生产。
该表的结果表明，在产油培养基中圆红冬孢酵母的油脂含量随着酵母提取粉的浓度提高而出现先上升后下降的趋势，会出现一个峰值，即圆红冬孢酵母在其他条件相同的情况下，圆红冬孢酵母在此处有最高的油脂得率。即当酵母提取粉浓度为0.04%时油脂产量最高。
4.结论
实验以圆红冬孢酵母菌株出发，通过了解圆红冬孢酵母的菌落形态，测定圆红冬孢酵母的生长曲线，比较鉴定、提取圆红冬孢酵母的油脂含量的方法，最后确定了以下的条件能有最高的油脂提取率，即：将种子液培养10-24h后进行接种，然后再产油培养的时间是5d,葡糖糖和酵母提取粉的量分别为“8.0%、0.04%”。可以通过镜检+索氏提取法的方法得出菌体的生长及油脂积累情况，可以为发展利用圆红冬孢酵母生产微生物油脂打下根基。
13
鸣谢
本课题的进行主要是由于导师教授的认真指导，在试验和操作过程中都得到了老师的帮助和大力支持，衷心地感谢导师在我进行毕业论文这段时间对我的教诲和关心。李雁群老师广博的知识、严谨的治学态度和对微藻、产油课题的细致研究着事令人佩服！李雁群老师也是个很亲切的老师，每每我实验遇到问题，我去找老师解惑时，尽管老师特别得忙，老师都愿意抽出时间来解答。对于我的论文撰写，老师也是非常细致地帮我做批注、修改。小到一个符号、字体和一个简单的错别字都帮我标记出来。可见李老师真的特别用心在帮我修改论文，真的很感动，谢谢老师！
在本实验完成过程中得到了食品科技学院老师指导的研究生师兄师姐的无私帮助和支持，他们提出了很多有用的意见，开阔了我的实验思路，本论文在老师和师兄师姐的帮助和指导下得以顺利开展。
由衷地感谢我的家人，他们是我强有力的后盾、是使我顺利完成学业的基石。 最后，向所有给了我帮助的老师、师兄姐、家人和朋友们表示深重的感谢！
14
参考文献
[1] 刘泽君 圆红冬孢酵母发酵生产微生物油脂的研究 [D] 天津科技大学 2013.3, 1-2
[2] 刘波, 孙艳, 刘永紅, 等．产油微生物油脂生物合成与巧谢调控研究进展[J]．微生物学报, 2005,
45(1):153-156
[3] 王常文, 崔方方, 宋宇. 生物柴油的研究现状及发展前景[J]. 中国油脂, 2014, 5,1-2 [4] 王瑞元. 发展微生物油脂前景广阔[C] 粮食与食品工业2014.08,21(4):1-2
[5] 蒲海燕, 贺稚非, 刘春芬 等. 微生物功能性油脂研究概况[J], 粮食与油脂, 2003(11):12-14 [6] 程云, 卢悦, 余世实. 巴西实施生物柴油计划的政策举措中外能源[J]. 中外能源, 2009, 5:41-46 [7] 王琦. 圆红冬孢酵母rhodosporidiumtoruloides21167菌株产油脂的研究[D] ,中国海洋大学 2012.06,
2-8
[8] 黄俊超. 小球藻制备生物柴油中油脂提取的研究[D] ,华南理工大学 2014.04,20-38 [9] 张嘉. 高产油脂酵母的选育及发酵工艺的研究[D] 浙江大学 , 2008. 06, 10-20
[10] 李小英, 聂小安, 陈洁, 等. 微生物油脂制备生物柴油技术研究现状及发展趋势[J],, 2015.06:1-5 [11] 曲威, 刘波, 吕建州, 等. 高产油脂斯达氏酵母菌株的选育及摇瓶发酵条件的初步研究[J], 辽宁师
范大学学报(自然科学版); 2006, (1): 1-3
[12] Paulson ND, Ginder RG. The growth and direction of the biodiesel industry in the United
States[M]; Ames; Center for Agricultural and Rural Development, Iowa State University, 2007, 1-3
[13] 赵宗保, 胡翠敏. 能源微生物油脂技术进展[J]. 生物工程学报, 2011, 27(3): 427?435. [14] 苗金鑫. 富含油脂的微生物的培养[D]，沈阳农业大学 2007.06, 15-35
[15] 彭枫, 赵雪冰, 刘灿明, 等．活性炭脱毒甘黯渣稀酸水解液用于酵母油脂的合成[J], 可再生能源,
2009, 27(4):32-36
[16] 周稳稳, 张永奎, 邹文婷, 等．圆红冬袍酵母在酒精废水中发酵产油[J], 化工进展, 2009,
29:172-175
[17] 李永红, 刘波, 赵宗保, 等. 圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究[J], 生物工
程报, 2006, 22(4):650-656
[18] Bozbas K. Biodiesel as an alternative motor fuel; Production and policies in the European
Union[J]. Renewable and sustainable energy reviews. 2008, 12(2):542-552 [19] 相光明. 产油脂酵母菌株的筛选[D], 山东农业大学 , 2009.05，20-50
[20] 胡洋．油脂酵母利用粗甘油发酵产微生物油脂的研究[D] ,华南理工大学 2016.06 20-44s [21] 何东平, 陈涛. 微生物油脂学[M], 化学工业出版社, 2005. 12. P228-231
15