总体积 5.0 ?l
注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。
⑥如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 ?C保温10 min。如果用的是CDS III引物，省略此步，进行步骤⑦。
⑦42 ?C保温10 min。
⑧加入1 ?l SMART III oligo，充分混合，42 ?C保温1 h。
⑨75 ?C保温10 min终止第一链的合成。
⑩降至室温，加入1 ?l RNase H（2 U）。
11 37 ?C保温20 min。
12 cDNA第一链合成产物应于-20 ?C保存，可用3个月。
（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第二链
根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。
表2 RNA量与最佳热循环数
总RNA/?g 1.0-2.0 0.5-1.0 0.25-0.5 0.05-0.25
Poly A+RNA/?g
0.5-1.0 0.25-0.5 0.125-0.25 0.025-0.125
循环数 15-20 20-22 22-24 24-26
⑴LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做2个100 ?l体系，对照做1个100 ?l体系）：
First-strand cDNA （from protocol A） 2 ?l Deionized H2O 70 ?l 10×advantage 2 PCR buffer 10 ?l 50×dNTP mix 2 ?l 5’RACE引物 2 ?l 3’RACE引物 2 ?l Melting solution 10 ?l 50×advantage 2 polymerase mix 2 ?l 总体积 100 ?l
⑵按照以下程序进行PCR反应： 1个循环 95 ?C 30 s X个循环 95 ?C 10 s 68 ?C 6 min 1个循环 68 ?C 5 min
⑶取7 ?l PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。
（2） 使用CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA
⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。
⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。
⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。
⑷将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。
⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。
注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。
⑹700 g离心5 min，纯化的cDNA收集到管中。
⑺将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。
⑻加入1/10体积3 mol/L醋酸钠（pH5.3），混匀。
⑼加入2.5倍体积无水乙醇。
⑽-20 ?C冰冻1 h。
⑾室温，14000 r/min离心20 min。
⑿小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。
⒀14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。
⒁沉淀于空气中干燥10 min。
注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。
⒂用20 ?l灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。
5 构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA融合表达文库的构建及筛选） （1） 构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。
（2） 按SMART technology步骤合成ds cDNA，其浓度为2-5 ?g/20 ?L。 （3） 用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下
物质：
①cDNA文库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株 20 ?l SMART-amplified ds cDNA （2-5 ?g） 6 ?l pGADT7-Rec，（Sma I-linearized）（3 ?g） ②Y1HGold [53/AbAi]的转化 5 ?l p53 fragment （125 ?g）
2 ?l pGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1 ?g）
将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 ?l涂100 mm平板。
文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。
（4） 将剩余的所有文库转化混合物（约15 ml）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平
板上，每板涂150 ?l。 （5） 倒置培养3-5 d。
（6） 3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆
数。
注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。
筛选的克隆数=[cfu/ml on SD/-Leu]×[dilution factor]×[resuspension volume（15ml）]
例如：resuspension volume=15 ml Plating volume=100 ?l
250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu plates
The number of clones screened=250 cfu/0.1 ml×100×15 ml=3.75 million
（7） 预期结果
阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。 文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。
6 阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离 （1） 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认
①将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。
②2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。
（2） 酵母克隆PCR消除重复克隆
①用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （Cat.No.630497）进行PCR，对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进行扩增。PCR管中加入以下反应物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 ?l H2O/Yeast 25 ?l 总体积 50 ?l
②按下述程序进行PCR反应：
94 ?C 1 min 98 ?C 10 s 68 ?C 3 min
③PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体
注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。