④如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。
⑤为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。
（3） 阳性cDNA质粒的分离获取 ①酵母中文库质粒的分开。
与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。
②从酵母中获取阳性cDNA质粒
为了鉴定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.630467）从酵母中获取阳性质粒。
③转化E coli并分离阳性cDNA质粒
用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin进行选择。
（4） 鉴别阳性和假阳性互作
酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性 阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。 假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。 用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认： ①用Yeastmaker Transformation System 2的试剂和small-scale转化程序将100 ng获取的捕获质粒转化到Y1HGold[Bait/AbAi]和Y1HGold[Mutant/AbAi]菌株中。 注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进行。
②在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100 ?l转化混合物1/10和1/100的稀释物。
③30 ?C恒温培养3-5 d后，预期结果如表所示。
表3 阳性和假阳性相互作用验证结果
A 阳性
样品 酵母菌
Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶
酵母菌
Y1HGold[突变/AbAi]+靶
B 假阳性
样品 酵母菌
Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶
选择培养基 SD/-Leu SD/-Leu/AbA
2 mm清晰的克隆
有 有
选择培养基 SD/-Leu SD/-Leu/AbA SD/-Leu SD/-Leu/AbA
2 mm清晰的克隆
有 有 有 无（或者很小）
酵母菌
Y1HGold[突变/AbAi]+靶 （5） 阳性克隆的测序分析
SD/-Leu SD/-Leu/AbA
有 有
一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入cDNA片段，验证与GAL4 AD序列融合的开放阅读框（ORF）序列，并与GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进行比较。