血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定
一、实验目的：
1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术
二、实验原理：
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋
白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。
A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低
于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法
A材料
样品：人混合血清
试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1oCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤
盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）
具体操作流程示意：
（一） 盐析+凝胶柱层析除盐：
取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解 上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白) 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析 柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检 测蛋白质 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤 继续用 2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤 收集含有蛋白质的峰液12滴 收集含有蛋白质的峰液12滴 BaCl2检测SO42-阴性 BaCl2检测SO42-阴性 用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡
（二）离子交换层析（纯化）：
用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡
除盐后收集的球蛋白 过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm） 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC 缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质 取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法） 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴， 连续收集3管 除盐后收集的清蛋白 DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用 于纯化清蛋白 过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm） 用1ml 0.0６mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白 磺基水杨酸检测蛋白质 2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)
（三）醋酸纤维素薄膜电泳：
DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液流洗再生平衡 收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴，连续收集2管
1、点样（如下图）：
- 点样线 + 点样区 （粗面）
1.5cm 2cm 点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多 2、电泳：
①薄膜粗面向下 ②点样端置阴极端
③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平 电压：110V 时间：50min
3、染色和漂洗：
电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景
颜色脱净为止。
取出膜，用滤纸吸干即可。 注意事项：
1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。 2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。
3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。
4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。
5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉