羧肽酶B只能水解以碱性氨基酸Arg、Lys为C-末端残基的肽键。 二硫桥的断裂
甲酸氧化法、巯基化合物还原法。用过量巯基乙醇处理可以使S-S还原为-SH，与此同时反应系统中还需要8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在使蛋白质变性，这样还原剂才能作用于原来处在分子内部的二硫键
多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 1、酶裂解法
最常见的蛋白水解酶有以下几种：
1、胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快），得到以Arg和Lys为C-末端残基的肽段。
2、胰凝乳蛋白酶：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr（芳香族）; 亮氨酸Leu，甲硫氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。
3、胃蛋白酶：R1和R2为苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快
4、糜蛋白酶：此酶专一性不强，断裂Phe、Trp、Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键 5、嗜热菌蛋白酶：R2=Phe、Ile、Leu、Trp、Val、Tyr或Met（疏水性强的氨基酸水解速度快）
6、葡萄球菌蛋白酶：在磷酸缓冲液中，断裂Glu和Asp；在碳酸氢铵缓冲液中，断裂Glu 7、梭菌蛋白酶：专门裂解Arg残基的羧基端肽键
2、化学裂解法
1）用溴化氰断裂，CNBr只断裂有甲硫氨酸氨基的羧基参与形成的肽键，大多数蛋白质含有少量甲硫氨酸，此法产生的肽段不多
2）用羟胺断裂，NH2OH在pH9下能专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不是很强 肽段氨基酸序列的测定
Edman化学降解法、酶降解法、串联质谱法 二硫桥位置的确定——对角线电泳法 用胃蛋白酶水解多肽链，将得到的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷不同分离开来；然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中使S-S断裂，这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽；滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳，大多数肽段的迁移速率不变，并位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离的对角线。
四、蛋白质的结构
稳定蛋白质构象的作用力主要是次级键或称非共价键，包括氢键、范德华力、疏水作用、盐键，此外共价二硫键也起很大作用
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蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列，包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫键。
蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间结构，不包括与其他肽段的相互关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。 蛋白质折叠的结果是使疏水基团埋藏在蛋白质分子内部，亲水基团暴露在外部，在形成疏水核心的同时，必然有一部分主链也被埋在里面。主链本身是高度亲水的，这样就产生矛盾，只有处于分子内部的主链极性基团（C=O、N-H）也被氢键中和，矛盾才能解决，在这种能量平衡中，蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象，即二级结构，主要包括α-螺旋，β-折叠，β-转角及无规卷曲等几种类型。
α-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为： 1）链的骨干结构为锯齿形，折叠成规则的周期性的右手螺旋； 2）螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基；螺距为0.54nm，两个氨基酸之间的垂直距离为0.15nm，每个残基沿轴旋转100°。螺旋直径（不计侧链）为0.5nm。
3）螺旋以链内氢键维系，与螺旋轴平行，是由第n个氨基酸残基的羰基氧与第n+4个氨基酸残基氨基氢形成，氢键封闭环包含有13个原子，用3.613表示。 4）R侧链基团伸向螺旋的外侧。 影响α-螺旋稳定的因素有：
1）极大的侧链基团（存在空间位阻）；
2）连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）； 3）有Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键），改变多肽链的方向并终止螺旋。 4）甘氨酸侧链基团是H原子，不能像其他侧链那样制约二面角
β折叠
1、 两个氨基酸残基之间的轴心距离为0.35nm（反平行式）及0.325nm（平行式）
2、 肽链按层排列，靠链间氢键维持其结构的稳定性，β-折叠结构的氢键是由相邻肽键主
链上的N-H和C=O之间形成的
3、 相邻肽链走向可以平行也可以反平行，肽链N端在同侧为平行式，不在同侧为反平行式 4、 肽链中氨基酸残基的R基交替分布在片层的上下
β-转角
在球状蛋白质中存在一种二级结构，当蛋白多肽链以180度回折时，这种回折部位就是β-转角，它是由第一个氨基酸残基的C=O与第四个残基的N-H之间形成氢键，使多肽链走向发生改变
纤维状蛋白质
纤维状蛋白质可分为不溶性和可溶性两类，前者有角蛋白、胶原蛋白、和弹性蛋白等；后者包括肌球蛋白和血纤蛋白原，但不包括微管、肌动蛋白细丝和鞭毛。 α-角蛋白主要由α-螺旋结构组成，结构稳定性由二硫键保证；
β-角蛋白含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主，链间主要以氢键连接，层间靠范德华力维系
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超二级结构：在蛋白质分子中，若干相邻的具有二级结构的肽段有规则地组合在一起，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位，称超二级结构（super-secondary structure）或模序（motif)。在多种蛋白质中充当三级结构的构件。 常见类型：α-螺旋聚集体（αα型）、α-螺旋和 β-折叠的聚集体（βαβ型）、β-折叠的聚集体（βββ型，包括β曲折和回形拓扑结构即希腊钥匙）。
结构域（domain）：由几个超二级结构单位折叠组成的特定区域，结构层次介于超二级结构和三级结构之间，其（球状蛋白）类型有：反平行α螺旋式、平行或混合型β折叠片式、反平行β折叠片式、富含金属或二硫键式等。 球状蛋白质三维结构的特征
1、含多种二级结构元件；2、明显的折叠层次；3、是紧密的球状或椭球状实体；4、疏水侧链埋在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面；5、表面有一个空穴
蛋白质的三级结构
蛋白质的三维结构是指由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。维系三级结构的化学键主要是非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。
结构特点：
1、许多在一级结构上相差很远的氨基酸在三级结构上相距很近；2、大的球形蛋白常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体，典型情况下常常含有特定的功能；3、球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心被排出，使得极性基团与非极性基团间的相互作用成为可能 蛋白质的四级结构
蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。亚基(subunit)就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链，无生理活性。维系蛋白质四级结构的是氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。
四级结构在结构和功能上的优越性：1）增强结构的稳定性（表面积与体积比降低）；2）使功能基团汇聚在一起；3）提高遗传经济性和效率（编码一个将装配成同源多聚体蛋白质的单体所需DNA比编码一条相对分子质量相同的大多肽链要少）；4）具有协同性和别构效应。
蛋白质多肽链的折叠
1、一级结构决定高级结构，即蛋白质的氨基酸序列决定了蛋白质的立体结构；2、疏水作用驱动这蛋白质折叠；3、折叠不是一个完全随机的过程，折叠悖论提出一个124氨基酸组成
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的核糖核酸酶有10种可能的构象，如果每10~13秒试1种构象，需要10年，但是核糖核酸酶完成折叠的时间约为1min。 五、蛋白质的性质
蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。
变性：某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。引起变性的主要因素是热、紫外光、高压、
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激烈震荡、有机溶剂、去垢剂以及强酸和强碱等。 变性蛋白质的性质改变：
① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：原来埋在内部的基团向外暴露，官能团反应性增加，易被蛋白酶水解，熟食易于消化
③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。
蛋白质的变性主要是次级键如氢键、盐键、范德华力等遭到破坏。
变性剂：尿素和盐酸胍，能与多肽主链竞争氢键，破坏蛋白质二级结构；SDS，十二烷基硫酸钠，破坏蛋白质内的疏水相互作用使非极性基团暴露于介质水中。
分子病：蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。镰刀形细胞贫血病(sickle cell anemia)，血红蛋白β-链第6位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。
六、蛋白质的构象与功能的关系
肌红蛋白（Mb）是哺乳动物细胞，主要是肌细胞储存和分配氧的蛋白质，由一条多肽链和一个辅基血红素构成，除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白，分子中多肽链由长短不等的8段直的α螺旋组成。在肌红蛋白中，铁是由原卟啉Ⅸ固定的，原卟啉Ⅸ与铁的络合物铁原卟啉Ⅸ称血红素，作为辅基非公价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中，根据其结合铁离子的形式，可分为亚铁血红素和高铁血红素。
血红蛋白（Hb）的主要功能是在血液中结合氧并转运氧气，由4个多肽亚基组成，两个是一种亚基，两个是另一种亚基，每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位。
肌红蛋白与血红蛋白的比较
1、 相同：血红蛋白和肌红蛋白有相似的三级结构（含8个α螺旋片段和铁卟啉Fe（Ⅱ）配
位），表明有相似的氧结合机理
2、 不同：肌红蛋白是单体蛋白，其氧结合曲线呈双曲线特征，表明在低氧时对氧有高亲和
力，利于从含氧量少的血液中吸取氧；血红蛋白是寡聚蛋白，氧结合曲线呈S形特征，表明在低氧时对氧有低亲和力，高氧使有高亲和力。 血红蛋白的别构效应
一个配基与蛋白质结合影响该蛋白质的其余结合位点与其配基的亲和性。配基指与蛋白质结合的物质，与别构部位结合，引起别构效应的配基称为别构效应剂。 降低血红蛋白与氧结合能力的物质：H+、CO2、BPG 1、H+、CO2促进氧的释放（Bohr效应）
+-++
CO2+H2O→H2CO3→H+HCO3；HbO2+H→HbH+O2；H+可以看成是血红蛋白结合氧的拮抗物，当pH下降时，Hb的氧分数饱和曲线向右移动，这种pH对血红蛋白对氧亲和力的影响，称为Bohr效应。当血液流经代谢迅速的肌肉时，由于这里的pH较低，CO2浓度较高，因此有利于血红蛋白释放氧气，使组织获得更多的氧，氧的释放又促使血红蛋白与H+和CO2的结合，缓冲pH降低引起的影响；当血液流经肺部时，O2浓度高，有利于血红蛋白结合氧并促进H+和CO2的释放，同时释放的CO2又有利于O2的结合。 2、BPG降低Hb对氧的亲和力 BPG，即2，3-二磷酸甘油酸
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ELISA（酶联免疫吸附测定） 原理：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
免疫印迹测定/Western印迹
对蛋白质样品进行凝胶电泳分离，然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起，进行电泳转移，将凝胶上的蛋白条带转到膜上，将膜封闭，再相继用第一抗体、酶标第二抗体以及底物进行处理，只有含待测蛋白质的条带显色。
制备单克隆抗体的基本步骤
多克隆抗体是由多个不同的B淋巴细胞在应答一个抗原产生的结合抗原中特异的不同的抗原决定簇的抗体；单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞群体合成分泌的，所有抗体识别同一的表位。
1、用感兴趣的抗原免疫小鼠脾脏，制成B淋巴细胞悬液；2、繁殖小鼠骨髓瘤细胞，白细胞的一种致癌性增殖；3、将B细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤的细胞系，它只合成一种抗体；4、细胞转移到只有杂交瘤细胞才能生长的介质中进行选择性培养；5、用ELISA筛查并找出分泌抗感兴趣的蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞；6、对所得的细胞株进行扩大化培养，从培养物中纯化所需抗体。 七、蛋白质的分离、纯化和表征 蛋白质的大小与形状
用化学组成测定、凝胶过滤法、渗透压法、SDS-PAGE 蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀
蛋白质表面的亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层；蛋白质表面的可解离基团，在适当的pH下，都带有相同的净电荷，互相排斥，并与周围的反离子过程稳定的双电层，所以蛋白质作为胶体是相当稳定的。可用盐析法（脱水化层）、有机溶剂沉淀法（破坏水化层，降低介电常数）、重金属盐沉淀法、生物碱沉淀法、加热变性沉淀法使蛋白质沉淀。
1、 在pH低时沉淀：蛋白质表面带上大量正电荷，使蛋白质变性，疏水基外露 2、 离子强度逐渐增大时，溶解度变大再变小：盐溶是因为蛋白质分子吸收某种盐类离子后，
带电层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强；盐析是因为大量的中性盐加入使水的活度降低，原溶液大部分自由水转变为盐离子的水化水，疏水基团暴露
3、 在等电点时溶解度最小：不带电荷，无斥力 4、 加热时沉淀：疏水基团暴露，溶解度降低
5、 非极性溶剂的加入使介电常数下降，溶解度降低：降低表面极性基的溶剂化作用，使蛋
白质内部形成氢键代替蛋白质与水形成的氢键
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