瓜蒌皮黄酮类化合物体外抗氧化作用研究
氧化也称氧化作用或者氧化反应,是指有机物在反应体系中引入氧或脱去氢的作用。氧化作用与人体的很多症状紧密相关,如:衰老、心血管疾病等。而氧化作用的发生,很多是由于自由基的存在而造成的。
人体内的自由基可分为:氧自由基和非氧自由基\氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的95%,包括超氧阴离子(02-)、轻自由基(OH-)、过氧化氢分子(H2O2)、氢过氧基(H02-)、烷氧基(RO·)、烷过氧基(ROO·)、氮氧自由基(NO·)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、氢过氧化物(R00H)以及单线态氧(102)等,它们又统称为活性氧(reactive oxygen speeies,1ROS),都是人体内最重要的自由基;非氧自由基主要包括氢自由基(H·)和有机自由基(R·)等。
因为自由基中存在孤对电子或不平衡电子,所以它们是极不稳定分子或原子。一般,活性氧往往产生于机体内的自然代谢或者机体外部化学物质的作用。活性氧可以通过链式反应攻击细胞内或者体液中的生物分子,如:蛋白质、DNA、脂质等,从而导致各种相关疾病的发生。
本实验将就瓜蒌皮总黄酮提取物的体外抗氧化性能进行系统研究,为瓜蒌皮进一步开发利用奠定科学理论基础。
1材料与方法 1.1材料与试剂 瓜蒌皮乙醇提取物
无水乙醇、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、硫代巴比妥酸、三轻基氨基甲烷(Tris),(分析纯)国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾 三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁(分析纯)沈阳沈一精细化学品有限公司、盐酸(分析纯)沈阳化学试剂厂 1,1-二苯基-2-苦基苯胁 sigma公司 ，卵磷脂 北京奥博星生物技术有限责任公司
1.2主要仪器设备 紫外可见分光光度计 1.3试验方法
1.3.1清除DPPH自由基的测定
精确称取DPPH 9.7mg,加入少量无水乙醇溶解后,以体积分数为95%的乙醇溶
液定容至250mL,制成浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液\取2mL已配制的DPPH溶液,分别加入1mL不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液,以95%乙醇补足到4mL,混匀,放置30min后,在517nm处测定样品吸光值As:,以95%乙醇为空白对照,测定Ac(李春阳,2006).以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照,按下式计算清除率及IC50
清除率/%=(Ac-As)/Acx100 式中:Ac一空白的吸光度
As:一样品的吸光度
以样品浓度与清除率作图,根据拟合方程求出清除率为50%时所需样品的浓度,即半数抑制浓度IC5o.
1.3.2抗脂质体过氧化能力的测定 1.3.2.1试剂的配制
1、脂质体PBS分散系(LLs):3oomg卵磷脂溶解于3omL 10mmol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲液),冰浴震荡(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。
2、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液:15gTCA,0.37gTBA,2.lmL浓盐酸依序放入1OOmL水中(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。
1.3.2.2测定步骤
分别于样品管中依次加入1mL卵磷脂溶液 (LLS)、lmL0.4mmol/L硫酸亚铁、1mL样品,混匀，避光,于37℃水浴60min,加入2mLTCA-TBA-HCl混合液,90-100℃水浴15min,迅速冷却,以30O0r/min离心10min,取上清液在535nm测定吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。参比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂,Vc为阳性对照(李颖畅,2008;莫开菊等,2006;张尔贤等,1996)。按下式计算清除率及IC50。
清除率/%=(Ac-As)/Acx100 IC50的计算同1.3.1。 1.3.3还原力的测定
取不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液1mL于试管中,依次加入2.5mL O.2mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5mL质量分数l%K3Fe(CN)6混匀,于55℃恒温水浴中温育2Omin后,迅速冷却,加入2.5mL质量分数10%的三氯乙酸混合后,以300Or/min
离心1Omin,取上清液2.5mL,依次加入2mL蒸馏水和O.5mL质量分数0.1%的FeC13溶液,充分混合,静置10min后,于700nm处测定样品吸光度值As:,吸光度越大,表示还原能力越强。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。用蒸馏水作参比,Ve为阳性对照(陈留勇等,2004)。
还原力=As-Ac
1.3.4清除超氧阴离子自由基(·02-)的测定
取4.5mLpH8.2的50mmol/L Tris-Hcl缓冲液,4.2mL蒸馏水,混匀,于25℃恒温水浴中保温2Omin,取出后立即加入在25℃预热过的25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL(以10mmol/LHCl配制,空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCI溶液),迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5min,加入8mmol/L HCl 1mL终止反应,于320nm处测定样品吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度汉Ac(Yen G.C,,ChenH.Y.,1995)。以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。
\清除率/%=(Ac-As)/Aex100 IC50的计算同1.3.1。
1.3.5清除轻基自由基(.OH)的测定
利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质,该物质在
510nm
下有最大吸收。反应体系中含
8.8mmol/L
H2O2lmL,10mmol/LFeso4lmL,1Ommol/L水杨酸-乙醇1mL ,分别加入不同浓度瓜蒌皮黄酮提取液1mL,最后加H2O2启动反应,37℃反应0.5h,在510nm下测定样品吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac(牛桂玲等,2009)。以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。
清除率/%二(Ac-As)/Acx100 IC50的计算同1.3.1。 1.4数据分析
采用DPS统计软件进行方差分析 2结果与分析
2.瓜蒌皮黄酮清除DPPH自由基能力
试验结果见图1和图2。如图1和图2所示,瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除率随着浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的IC50为16.09μg/ml, Vc的IC50为81.44μg/ml,表明瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除率明显高于Vc。说明瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基有显著的清除作用。
908070清除率（%）605040302010005101520黄酮浓度（μg/mL）2530 图1瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除作用
Fig. 1 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on DPPH radical.
706050清除率（%）4030201000204060Vc浓度（μg/mL）图2 Vc对DPPH自由基的清除作用
Fig. 2 The scavenging effect of aseorbie acid on DPPH radical
80100120 2.2瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力
试验结果见图3和图4。如图3和图4所示,瓜蒌皮黄酮对由F2+引发的卵磷脂脂质体过氧化具有明显的抑制作用,抑制率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,vc亦是。瓜蒌皮黄酮的IC50为0.46mg/mL，Vc的IC50为1.52mg/mL,表明瓜蒌皮黄酮抗脂质过氧化能力明显优于Vc。说明瓜蒌皮黄酮具有显著的抗脂质过氧化能力。
6050抑制率（%）4030201000100200 300400黄酮浓度（μg/mL)500600 图3瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力
Fig.3 The capability of flavonoids from pericarpium trichosanthis on inhibiting lipid Peroxidation
706050抑制率（%）40302010000.511.52Vc浓度（μg/mL）2.53 图4 Vc抗脂质体过氧化能力
Fig. 4 The capability of ascorbic acid on inhibiting lipid peroxidation