教学准备
1. 教学目标
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
2. 教学重点/难点
教学重点：
凝胶色谱法的原理和方法 教学难点：
样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
3. 教学用具
教学课件
4. 标签
教学过程
（一）引入新课
蛋白质的知识回忆：
含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。 2、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸 4、分子结构： 氨基酸—多肽—蛋白质 肽键：—CO—NH—
5、相对分子质量：高分子化合物
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？
（二）蛋白质分子的差异性 1．基础知识
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：（见课件图）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1．2缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1．3凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
例：聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。
2.原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。
3. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
（三）、血红蛋白的提取和分离实验设计 2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。 2.2选择实验材料
（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。
（2）请阅读投影资料，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由血浆和血细胞两部分组成。
血细胞中红细胞细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是血红蛋白。
该化合物是由两个α－肽链、两个β－肽链和四个亚铁红素基团构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁红素基团。
2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：
洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？ 除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。
红细胞的洗涤过程为：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？ 加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。
补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：
10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×斗分离出血红蛋白
2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。
透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。
在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。
思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。
总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。
2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。 根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。 色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱 下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材： 色谱柱的装填过程。
样品加入和洗脱。其基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质 至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项： （1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。