(2)凝胶的预处理:沸水浴法时间短,还能除去微生物和气泡
(3)色谱柱的装填:装填尽量紧密,降低颗粒间隙;无气泡;洗脱液不能断流。 (4)色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。 (四)、实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理?你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗? 观察你处理的血液样品离心后是否分层(见教科书图5-18),如果分层不明显,可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外,离心速度过高和时间过长,会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀,也得不到纯净的红细胞,影响后续血红蛋白的提取纯度。
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生?你的色谱柱装填得成功吗?你是如何判断的? 由于凝胶是一种半透明的介质,因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯,检查凝胶是否装填得均匀。此外,还可以加入大分子的有色物质,例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整,说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡,轻轻敲打柱体以消除气泡,消除不了时要重新装柱。
3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即:样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,即:样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
4、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗?请描述红色区带的移动情况,并据此判断分离效果?
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离的效果不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。
课堂小结
当今生物科学在蛋白质研究领域的进展,说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性,进而说明本节课的目的,以血红蛋白为实验材料,学习蛋白质提取和分离的一些基本技术,尝试从血液中提取和分离血红蛋白,了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后学习这些技术带下基础。
板书
专题五 第三节 一、蛋白质分子的差异性 1凝胶色谱法 2缓冲溶液 3凝胶电泳法
二、血红蛋白的提取和分离实验设计 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。三、实验结果分析与评价
血红蛋白质的提取和分离