生物技术大实验
实 验 报 告 集
班级 生物技术1212 学号 1220212206 姓名 宋扬 使用时间 2015.12.14 至 2015.12.19 组别 一
苏 州 科 技 学 院 化 学 与 生 物 工 程 学 院
苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制
实验室学生守则
一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员
的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、
准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操
作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪
动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和
吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管
理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、
水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作， 经指导老师许可后，方可离开。
苏州科技学院化学与生物工程学院
苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制
实 验 报 告
实验名称 组别 辅酶Q10发酵过程工艺控制 九 实验结果及实验分析与讨论： 摘要：通过辅酶Q10产生菌类球红细菌Rhodobacter sphaeroides的培养，学会菌种在小型发酵罐中培养的过程，包括培养基和设备的灭菌、种子的培养、接种、发酵工艺控制等，进一步巩固所学的有关发酵过程的控制、中间补料、溶氧控制、变温发酵及代谢调节等工艺，学会分析代谢曲线，掌握有关参数及辅酶Q10的定量分析方法。 关键词：辅酶Q10，补料发酵，葡萄糖量，溶氧测定 辅酶Q10（Coenzyme Q10），是一种位于线粒体上的脂溶性化合物，化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌。辅酶Q10的制备方法有组织提取法、微生物发酵法和化学合成法。目前，我国国内多家公司均实现了辅酶Q10的工业化生产，多采用微生物发酵法，且据报道，最高产量已达到3000mg/L。葡萄糖是碳源中最易利用的糖,几乎所有的微生物都能利用葡萄糖,所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分,并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。适量地增加葡萄浓度可以有效提高产物的合成量。因此，选择合适的葡萄糖补加方式并合理控制培养基中葡萄糖的浓度有利于产物的合成。 本试验采用类球红细菌Rhodobacter sphaeroides进行深层液体发酵生产辅酶Q10，发酵方式为流加分批发酵。通过流加补料将发酵过程中葡萄糖浓度分别控制在10g/L-15g/L,5g/L-10g/L,探究发酵过程中维持葡萄糖不同浓度对类球红细菌发酵生产辅酶Q10的影响。 一、实验的仪器和试剂 1、仪器 BIOTECH-7BG型发酵罐、高效液相色谱、显微镜、台式离心机、旋转蒸发仪等。 2、菌种 类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 3、培养基 （1）种子培养基（g/L）：葡萄糖 3，酵母提取物 8，NaCl 2，KH2PO4 1.3，MgSO4·7H2O 0.25, 1mL 辅液 （2）发酵培养基(g/L) : 葡萄糖30,甘露醇7.5,玉米浆干粉3，鱼粉蛋白胨3，谷氨酸钠5, NaCl 3.5 硫酸铵 3，KH2PO4 3，MgSO4 ·7H2O 15 ,FeSO4 1.25,MnSO4 0.12,1mL 辅液；用NaOH调pH至 7.0（发酵罐培养基加3ml 泡敌） 辅液（g/L）：盐酸硫胺 1，生物素0.015，烟酸 1，CuSO4 0.1。 （3）补料培养基(g/L)：葡萄糖300 （4）发酵消泡剂配比（v）：泡敌∶水=1∶10。 （5）培养基灭菌方法：培养基等配好后在蒸汽灭菌罐内于115℃下灭菌30分钟。 二、实验的步骤 1、发酵工艺条件路线为 平板活化 → 菌种子斜面 → 摇瓶种子 →罐发酵。 2、斜面种子培养 从平板培养基上单菌落接种于斜面培养基上，32℃恒温培养3d。 3、摇瓶种子培养 250ml摇瓶加入50 ml 种子培养基，灭菌后冷却，挖一约0.5cm2小块斜面放入培养基中，30℃，200r/min，培养24h。 4、发酵 苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制 （1）罐发酵培养 以8%（v/v）接种量接种于5L（装液3L）发酵培养基中，32℃，pH6.8±0.2，0.03Mpa，3L/min（初始）,200 r/min（初始），补料分批培养，用氨水自动调节pH，到120小时（4~5d）左右放罐。 接种后培养2-3h后，通过调节空气流量和转速，控制溶氧（DO）在50%的水平。发酵液pH会先上升再下降，待其降至6.8，通过补加氨水，控制pH在6.8。每4h测一次葡萄糖含量，计算补料体积，分别维持葡萄糖浓度 （A）1211班：葡萄糖浓度维持在10-15 g/L。 （B）1212班：葡萄糖浓度维持在5-10 g/L。 补料速率：根据还原糖分析结果及溶氧水平情况进行补料（30-60min补料一次）。 每班取3个摇瓶测定有关参数。 （2）参数测定及记录 在线参数每1hr记录一次；离线参数每8hr取样分析一次，包括总糖、还原糖、氨基氮、菌体浓度、pH、辅酶Q10含量等。 （3）放罐条件 待发酵后期，辅酶Q10产量下降，溶氧上升，pH上升，开始下罐。 5、离线参数测定 在发酵过程中每4小时取一次样分析以下项目： (1) 美蓝染色，镜检观察，并记录类球红细菌细胞菌体形态。 (2) 菌体浓度测定：干重法。（见附录1） (3) 还原糖测定：生物传感分析仪。（见附录2） (4) 取发酵液离心后的上清液用甲醛滴定法测氨基氮。（见附录3） (5) 辅酶Q10的提取及定量测定：用酸热法提取Q10（在90℃水浴锅加热，注意不要用电炉加热），用HPLC测定辅酶Q10的含量。（见附录4） 6、在线参数测定 在发酵罐上连续测定pH、溶氧(DO)、转速、流量、温度等。 7、记录所测参数，记入辅酶Q10发酵批报表。 三、辅酶Q10发酵过程有关离线参数的分析方法 1、 菌体浓度的测定 (1)菌体浓度的测定用离心法 取5mL菌液于已称好管重（W0）的10mL离心管中（每次3个平行），4℃下离心15min，离心转速为 5000 rpm。离心所得菌体用稀盐酸溶液(0.05M HCl:约4mL HCl加水至1L)洗涤两次，称湿重W1，。注意：洗涤时，要充分震匀。打开离心管盖，至80℃烘箱中烘至恒重，称干菌体与离心管重量W2。 (2)计算公式 湿重X1=(W1－W0)×20 干重X2=(W2－W0)×20 W1：湿菌体与离心管重量，g； W2：干菌体与离心管重量，g； W0：离心管重量，g； 单位：g/L。 2、发酵液中还原糖测定 生物传感分析仪测定发酵液中还原糖 测定操作 在“准备就绪…”状态下，按“运行”键，仪器自动清洗2次，以更新反应池和管道内的缓冲液，清洗结束后进入自动定标状态。这时，注入标样，仪器自动开始测定标样并定标，测定完苏州科技学院化生学院学生实验报告 生物技术大实验 发酵工程工艺控制 成后，自动清洗一次，进入下一测定循环。仪器根据上次定标时的测定误差，自动判断是否需要继续定标，如需要，则再次提示定标。当完成仪器标定后，绿灯不再闪烁，仪器进入测定样品状态。注入样品，根据结果确定要稀释的倍数。初始为40倍。 3、发酵液中氨基氮的测定 （一）实验材料 (1)中性甲醛溶液 将试剂级甲醛（36-37%）调到PH7（用 PH计检查）。或是在50ml36-37%甲醛中加入几滴0.5％酚酞乙醇水溶液，然后用0.2N氢氧化钠溶液滴定到微红。（需临用前配制，若放置一些时间后，在使用前要重新中和。） (2)酚酞指示剂 0.5%酚酞的50%乙醇溶液。 (3)标准碱溶液 0.1N 氢氧化钠溶液，使用前应标定。 (4)溴酚兰指示剂 0.05%溴酚兰的20%乙醇溶液。 （二）实验方法 (1)分别吸取发酵液离心上清液2.0ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各加蒸馏水5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入7ml蒸馏水，做空白对照。 (2)向上述三个瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，混匀，加溴酚兰指示剂2滴，加酚酞指示剂4滴。 (3)用标准0.100mol/LNaOH溶液滴定至红色，分别纪录消耗的NaOH毫升数。 4、菌体中辅酶Q10含量提取与测定 (1)菌体细胞的破碎 酸热法：酸热法处理菌体主要是利用盐酸对细胞中的糖及蛋白质等成分的作用,疏松细胞的结构，再经过沸水、冷冻处理，使细胞达到破碎的效果，辅酶Q10得率相对较高，操作也相对简单。 酸热法：取1ml发酵液，加入0.2mL 0.1 mol/L的盐酸，于90°C水浴锅中，水浴处理15 min。破壁好迅速冷却，5000rpm离心10min，弃尽上清。加入5mL提取液（乙酸乙酯：乙醇=5:3，体积比），漩涡震荡仪上混匀，置于超声波清洗仪中超声抽提15min,暗室中抽提15min,每隔5min摇匀一次。将抽提液离心10min。上层有机相0.46μm滤头过滤，待测。 (2)辅酶Q10含量的分析 辅酶Q10用HPLC进行分析，液相分析仪器为安捷伦，色谱柱为C18反相柱（5μm×4.6mm×150mm）。流动相为甲醇：异丙醇=3：1，柱温箱为40℃，流速为1mL/min，检测波长是275nm。辅酶Q10标准品梯度稀释后经HPLC分析建立。 辅酶Q10标准曲线：y=0.06729x R2=0.99996 (x为峰面积，y为辅酶Q10浓度mg/L) 菌体中辅酶Q10含量y=0.06729*5x=0.33645x (提取时，辅酶Q10稀释了5倍)