（5）为什么相差显微镜可以直接观察活体样品？ （6）什么是荧光?它是怎佯发生的? （7）荧光显微术为什么要以汞灯当光源？
（8）激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及其区别?两者有何关系? （9）二向色镜的作用原理?如何选用?
实验二 血涂片的制作和细胞形态观察及细胞计数
【实验安排】 ( 共 3学时 ) ：
1、教师讲解实习内容，示范血涂片制作、染色 ( 约 30 分钟 ) 。
2、同学两人一组，相互采血，各自独立完成血涂片制作、染色、红细胞计数 ( 约 120分钟 ) 。 3、书写实验报告 【目的要求】
1、掌握血涂片的制备染色方法
2、认识各种血细胞的典型形态，了解细胞形态的多样性 3、掌握细胞计数板的结构和细胞计数方法 一、血涂片的制备与血细胞形态观察 【实验原理】 1、血涂片的制备：
涂片是一种基本的临时制片技术。血涂片是血液学研究中最基本的技术。血涂片的制作就是将血液样品制成单层细胞的涂片标本的过程。经过瑞氏染色，对各种血细胞形态进行观察。 2、瑞氏染色原理：
瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
美蓝(又名亚甲蓝mehylene blue)，通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为天青. 伊红(又名曙红cosin)通常为钠盐即伊红钠。
美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀, 即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后, 又重新解离为带正电的美蓝（蓝色）和带负电的伊红离子（红色）。
细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用. 各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样. 因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩
嗜酸性颗粒与酸性染料伊红结合染粉红色;
嗜碱性物质与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色; 中性物质成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色; MCL
+
–
+ NaE
+–
ME + NaCL 【实验用品】
1、 器材：显微镜、医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、染色缸 2、 试剂：瑞氏染液、蒸馏水、pH6.4－6.8 PBS缓冲液 【方法与步骤】
1、 血涂片的制备与染色观察
(1)、采血：先用75%酒精棉球消毒左手无名指局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。
待血液从针孔流出，用干棉花擦去第一滴血。
(2)、涂片：轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。将血滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的
推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后使推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜。
（3）、待干：血涂片制成后可手持玻片在空中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.
（4）、染色：将血膜平放在染色架上. 加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定1～3分钟. 滴加等量缓冲液或新鲜
蒸馏水,与染料混匀染色5-10（2～5）分钟. 用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。
（5）、观察：分别在低倍镜、高倍镜、油镜下观察血细胞的形态。 二、红细胞计数 【实验原理】
1、血细胞计数板的结构血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板，在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格，每个大方格的容积为0.1ul。
四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。
中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。
2、血细胞计数：用相应的稀释液将血液稀释若干倍，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。 稀释血液有血细胞吸管法和试管法，本实验采用后者。 计算公式：
5个中方格内红细胞数×5×10×10×200（稀释倍数）= 红细胞数/L血液 【实验用品】
1、 器材：显微镜、血细胞计数板、移液管 2、 试剂：生理盐水、抗凝全血 【方法与步骤】
1、 血液稀释：用移液管量取0.1ml抗凝全血，加入19.9ml生理盐水中稀释，混匀。
2、 充液：取干洁的计数板，置于水平的桌面上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，
将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃，再重新充液。 3、 计数：找到计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺
序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。
4、 计算：按计数室构造及血液稀释倍数,将红细胞计数结果换算成每升血液
中红细胞的个数。 【实验注意事项】
1、 使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干
燥,中性、无油腻。
2、 细胞染色对氢离子浓度十分敏感,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异
常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。
3、 推片时用力要均匀，否则容易形成波浪状，厚薄不匀。
4、 一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。
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5、 血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落, 因此血膜必需充分干燥. 血片制好后最好立即
固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。
6、 染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长，或应适当增
加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.
7、 染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.
8、 冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.
9、 充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。 10、计数板、盖玻片、吸血管、血片等用过后必须立即按要求洗涤干净。 染色结果
在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚, 粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色. 【实验报告】
1、 记录血涂片中各种类型细胞形态及染色结果 2、 计算每升血液中红细胞的数量
实验三 叶绿体的分离与观察
【实验安排】 ( 共 3学时 ) ： 1、教师讲解( 约 30 分钟 ) 2、同学六人一组，分离叶绿体 3、书写实验报告 【目的要求】
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法 【实验原理】
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 【实验用品】
(一) 材料 新鲜菠菜
（二）器材 普通离心机、研钵、天平、光学显微镜、250m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、10m1离心
管10 支、纱布若干、载玻片和盖片等。 （三）试剂 0.35mol/L NaCl 溶液，0.01%丫啶橙 【方法与步骤】
1. 游离叶绿体的制备与观察
（1） 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织
捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。 （3）将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。 （4）取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。
（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 （6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。
（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。
（8）取叶绿体悬液1 滴滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察自发荧光。
（9）取叶绿体悬液1 滴加0.01%丫啶橙1滴混合后，滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察次生荧光。 2、菠菜叶手切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1滴0.35mol/L的NaCL,加盖片后轻压，置显微镜下观察。
（1）在普通光镜下观察。 （2）在荧光显微镜下观察。
（3）用同样方法制片，但滴加l一2滴0.01％丫啶橙染液染色染色1min，洗去余液，荧光显微镜下观察。 3. 组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。 【实验结果】
一、叶绿体的分离与观察
1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色自发荧光；
3. 加入丫啶橙染色后，叶绿体发出桔红色次生荧光．而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 二、菠菜叶手切片观察
1、在普通光镜下可以看到3种细胞
(1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。