4、显微镜观察时先用低倍镜找，找到后转高倍镜观察 人口腔上皮细胞的光镜观察
1、涂片：用干净牙签刮取人口腔上皮细胞，置于1.5ml离心管中，加1ml生理盐水，混匀后3000转离心10分钟，剩0.5ml上清液，吹管吹打均匀、涂片、晾干。 2、漂洗：M缓冲液洗3次。
3、处理：1％Triton X－100 37℃处理30分钟，M缓冲液洗3次。 4、固定：3％戊二醛固定15分钟，磷酸缓冲液洗3次，滤纸吸干。 5、染色：0.2％考马斯亮蓝R250染色5分钟 6、封片：水洗制成临时片，镜检。 人口腔上皮细胞骨架观察结果
实验八 线粒体的超活染色与观察
【实验目的】
1. 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。 2. 学习一些细胞器的超活染色技术。 【实验原理】
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化
以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分．主要是染料的“电比学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离产．而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作入活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀谈的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具备溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性。易于被细胞吸收。詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色．这可能是与液泡中某种蛋白质有关。 【实验用品】
（一）材料 人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
（二）器材 显微镜、恒温水浴锅、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 （三）试剂 1．Ringer 溶液
氯化钠 0.85g 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml
2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）
称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。 3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）
取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。 4．10％、1：3000中性红溶液
称取0.5g中性红溶于50m1 Ringer 溶液。稍加热(30-40C)使之很快溶解。用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存。否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1％中性红溶液1m1加入29m1 Ringer 溶液混匀。装入棕色瓶备用。
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【实验操作】
1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴詹纳斯绿B 应用染液。
(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色
10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分
布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。 2. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察
(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，
染色10～15min。
(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒
体的形态与分布。
3、植物细胞液泡系的中性红染色观察 （1）实验前，培养大蒜根尖
（2）．用双向刀片把根尖(约l一2cm长)小心切取一纵切面，放入载玻片中内的1：3000中性红染液中，染色5—
10min。
（3）吸去染液，滴一滴Ringer 溶液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖片，使根尖压扁，利于观察。 （4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，
这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区，在一些已分化长大的细胞，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧近细胞壁处。 【实验报告及作业】
1．用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?
2．根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅? 3、绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞中线粒体的形态与分布。
实验九 离子胁迫诱导洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡
【实验安排】 1、 理论讲解 2、 一人一组操作 【实验目的】
1、 了解细胞凋亡的形态学特征 2、 了解环境胁迫对细胞凋亡的诱导作用 【实验原理】
细胞凋亡(apoptosis) 是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为,是一个主动和高度有序的过程。细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。
细胞凋亡的研究最早始于对动物的研究。植物细胞由于覆有细胞壁,难于操作与检测。因此,凋亡研究相对起步较晚。现在许多研究证明,植物中也普遍存在凋亡现象,如植物正常生长发育过程(胚的发育,导管筛管的形成,根、茎、叶的发育等)、对环境的胁迫反应及被病原体侵入引起的超敏反应中等。
本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料,以不同浓度Ca量凋亡小体的形成。
NaCl 、CaCl2 等离子胁迫剂能刺激线粒体外膜上的受体,使线粒体膜通透性改变,线粒体跨膜电位的消失,线粒体通透性增高,从而导致细胞色素C(Cyt C) 、凋亡诱导因子(AIF) 等促凋亡物质的释放,最终导致细胞凋亡。
目前的研究表明,在许多细胞凋亡过程中,都伴随胞内自由Ca的大幅增加,特别是在凋亡早期,Ca急剧增加,提示Ca
2 +
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和Na作为凋亡诱导剂,得到明显的诱导效果,观察到大
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往往表现出
可能是启动细胞凋亡的早期信号。细胞内、外一些凋亡因子,可能激活内质网、线粒体上的钙通
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道,使其中的Ca大量释放,并打开质膜上的钙通道,使胞外Ca内流,导致细胞质内Ca增加,进而诱导细胞凋亡。而Ca
2 +
依赖的凋亡信号途径又可以被高盐(NaCl)所诱导。本实验中CaCl2 中的Ca
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可能通过细胞质膜上的钙通道进入
细胞质,使细胞质内Ca浓度急剧增加,从而高效诱导细胞凋亡。并且,Ca还能激活相应的核酸内切酶及参与凋亡相关信号的转导等。因此CaCl2对凋亡的诱导效率比单纯的盐胁迫剂NaCl略高。 【实验用品】
1、材料： 洋葱鳞茎内表皮 2、器材：显微镜、载玻片
3、试剂：0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2；改良苯酚品红染液 【实验步骤】
1、预处理及洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导 取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时,使其活化。
2、自培养好的洋葱鳞茎上切取1cm 左右的内表皮若干,分成三组。第一组是正对照,为正常细胞。第二组是试验组,分四管,每管10 片洋葱内表皮,分别于0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2中培养。第三组是负对照,为煮沸5min 的坏死细胞。
3、细胞凋亡的形态学观察 分别于2 、4 、6 、8 、10 h 取样,改良苯酚品红染液染色20min后制片。观察细胞形态变化。 【实验结果】
1、 未经处理的正对照组,细胞膜完整,细胞核呈球形、染色均匀,细胞质均匀透明。
2、 经煮沸处理5min 的负对照组,细胞壁、细胞膜裂解,细胞核有裂解现象,细胞质内分布有不均匀碎末状物质,细
胞内物质外溢,不能保持细胞的完整性。
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3、 经0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2 处理的洋葱内表皮细胞,均能诱导产生凋亡现象。随处理时
间的增长,凋亡细胞数目大大增加,凋亡的形态学变化也越来越明显，但同时坏死细胞数量大大增加。细胞膜破损,细胞核裂解,细胞内含物外泄,不能保持细胞完整性。
实验十 巨噬细胞吞噬现象的观察
【实验安排】
1、 讲解教学内容，示范小鼠的抓取、腹腔注射以及处死方法 2、 学生每六人一组，解剖一只小白鼠 【实验目的】
1、 通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作 用的过程及其意义。
2、掌握小鼠腹腔注射给药和脊椎脱臼处死方法。 【实验原理】
细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方式、也是原始防御作用。随着动物界的进化,在高等动物中，则发展生成大小两类吞噬(即巨噬细胞和嗜中性粒细胞)，专司吞噬作用，成为非持异免疫功能的重要组成部分。
巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞。当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体或异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，形成吞噬泡，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成异噬溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排出细胞外。
通过观察细胞的吞噬能力可以分析判断机体的免疫水平。 【实验用品】
(1)器材；显微镜、注射器、载玻片、盖玻片、解剖剪、镊子、解剖盘。 (2)试剂：中华墨汁 用生理盐水1：7稀释、研磨，用前煮沸，凉后待用。 (3)材料：小白鼠 【实验步骤】
1、在实验前一天，给小白鼠腹腔注射稀释墨汁1rnl，以诱导腹腔内产生较多的巨噬细胞。
注射时先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上。用左手拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按任尾巴及后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部后1/2处的—侧注射。 2、实验时．每组取一只注射过的小白鼠，再次腹腔注射稀释墨汁1ml，轻按小 白鼠腹部．使悬液分散。
3、20min后，用脊椎脱臼法法处死小鼠(右手抓住鼠尾，用力向后拉．左手拇指与食指同时向下按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致鼠死亡)。