水溶性量子点的合成表征
及生物毒性测定
王佳琪 舒凡 刘林 章晓雯 齐悦 柳慧颖
（武汉大学 化学与分子科学学院 湖北 武汉 430072）
摘 要：以Cd(CH3COO)2·2H2O、K2TeO3 为原料，在NaBH4为还原剂和巯基乙酸(TGA)为配体的条件下，以一步水相法合成CdTe量子点。通过紫外-可见光谱和荧光光谱表征不同反应时间得到的量子点，并计算其粒径、浓度和荧光量子产率，并将不同浓度的CdTe量子点与酵母细胞混合培养，用Biomass法测定CdTe量子点的生物毒性。
关键字： 量子点 荧光量子产率 生物毒性 中图分类号：O 643 文献标识码：A
0 引言
纳米材料由于其特有的光学、电学以及磁学性能在化学、物理、生物、医学以及材料科学 等领域得到了广泛的应用。纳米荧光量子点由于其荧光量子产率高、发射光谱可调、激发光谱 宽和发射光谱窄等独特的光学性能被广泛用于生物医学成像以及生物检测等领域。随着纳米材 料在生物医学领域的应用越来越广泛，纳米材料的生物学效应也引起人们的广泛关注。
量子点是准零维的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100 nm以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应特别显著。半导体量子点又称为半导体纳米晶或半导体纳米粒子是一种由II-Vl族（CdSe，CdTe，CdS，ZnTe，ZnO）或III-V族（InAs，GaSb）和IV族（Si，Ge）元素组成的纳米颗粒，尺寸小于或者接近激子波尔半径（一般直径不超过10 nm），具有明显的量子效应。
本实验旨在以水溶性量子点为例，通过检测量子点对细胞生物活性的影响，考察纳米材料的生物学效应，同时为检验其他纳米材料以及化学物质的生物学效应提供一个普适性的方法。
实验所用CdTe量子点通过一步水相法合成，其中Cd(CH3COO)2?2H2O作为Cd源，K2TeO3作为Te源，NaBH4作为还原剂，巯基乙酸作为配体，涉及的主要化学反应为：
2TeO32- + 3BH4- + 6OH- = 2Te2- + 3BO33- + 9H2O
Cd2+ + Te2- = CdTe
K2TeO3经NaBH4还原后与Cd2+结合生成CdTe，在巯基乙酸的保护下，通过控制反应时间可以得到不同粒径的CdTe晶体。CdTe晶体的荧光光谱可以通过荧光光谱仪测得，其浓度可以通过紫外吸收光谱结合摩尔消光系数进行计算。
本实验采用biomass法，检测纳米材料主要是CdTe量子点对酵母细胞存活和生长的影响。酵母菌的死细胞和活细胞在630nm处的吸光度有所差异，通常一定体积溶液内的生物量（活细胞数量）与吸光度成正相关性，因此可以比较在630nm处的吸光度考察CdTe量子点对酵母细胞生物活性影响的浓度依赖性。将不同浓度的CdTe量子点与酵母细胞混合培养，测定不同培养条件下培养不同时间的酵母细胞在630nm处的吸光度，绘制吸光度曲线，记录不同浓
度下酵母细胞的生长情况。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂
氢氧化钠，Cd(CH3COO)2·2H2O，巯基乙酸(TGA)，NaBH4，K2TeO3，酵母细胞。所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。 1.1.2 仪器
KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），VORTEX-5振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），LX-300型迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），Maxait恒温摇床（太仓市实验设备厂），TG16-WS台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），新苗净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司），UV-3100紫外-可见光谱仪，RF-5301PC荧光光谱仪。 1.2 实验步骤
1.2.1 CdTe水溶性量子点的制备[1]
在100 mL三口圆底烧瓶中加入25 mL的超纯水，然后加入0.05 mmol Cd(CH3COO)2·2H2O (13.3 mg)搅拌均匀后加入4 μL的TGA，用1 mol/L的NaOH溶液调节体系的pH至10.5，搅拌5 min以上。在100 mL的圆底烧瓶中加入0.01 mmol的K2TeO3 (2.5 mg)溶解于25 mL超纯水中，用磁子搅拌直至其完全溶解。
将上述的两种溶液混合并加入20 mg的NaBH4，继续搅拌5 min。之后，控制体系的反应温度为100 °C，反应回流4 h。分别在反应时间为0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h及4 h时收集1 mL反应溶液。
1.2.2 CdTe量子点的紫外-可见光谱表征
用紫外-可见分光光度计测得反应时间控制在0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h及4 h的CdTe量子点的紫外-可见吸收光谱，以超纯水作为参比，光谱扫描范围400-700 nm，从而测得CdTe量子点的量子限域峰(λ)。 1.2.3 CdTe量子点的荧光光谱表征
利用荧光光谱仪表征上述样品荧光光谱特性，激发波长388 nm，扫描范围450-700 nm，根据量子点的荧光强弱，调节激发狭缝和发射狭缝宽度，测得量子点的荧光光谱，从中得到量子点荧光光谱的半峰全宽值（亦称半宽度full width at half maximum，fwhm值）。由经验公式[2]：
CdTe：D=（9.8127×10-7）λ3-（1.7147×10-3）λ2+（1.0064）λ-（194.84）
求得CdTe量子点的粒径D，随后由ε=10043（D）2.12计算得到CdTe的摩尔消光系数。经紫外-可见吸收光谱可得CdTe量子点的吸光度Am，经公式A=Am（fwhm）PL/ K’其中K’=29， 可得换算后的吸光度A，经由A=εCL可得CdTe量子点的浓度。 1.2.4 CdTe量子点荧光量子产率的测定
称取一定的罗丹明B粉末溶解于无水乙醇中，配制成浓度为1×10-5 mol/L的溶液，用超纯水稀释一定倍数（罗丹明B在超纯水中的量子产率按89%计算），调节罗丹明B在388 nm
下的吸光度使其接近于~0.01，并测得388 nm激发条件下的荧光光谱，求得其积分荧光面积。
调整CdTe溶液的浓度，使得CdTe量子点的浓度在388 nm下吸光度小于0.1，之后测试该浓度下CdTe量子点在388nm激发下的荧光发射光谱，求出其积分荧光面积，根据下列公式计算CdTe量子点的荧光量子产率：
Yu = Ys *(Fu*As)/(Fs*Au)
式中，Yu和Ys分别表示待测物质和参比标准物质的荧光量子产率，Fu和Fs分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度，Au和As 分别表示待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸光度（A=εbc）。
1.2.5 Biomass法测定CdTe量子点的生物毒性[3]
将处于对数期的酵母菌摇匀，取500 μL于离心管中，经8000 rpm离心5 min，去除培养基，之后加1×PBS再洗涤一次，用500 μL 1×PBS分散。
通过荧光以及紫外光谱测得的相关数据计算反应4 h的量子点的浓度，通过离心浓缩以及稀释的方法将量子点配制成约为0 μM 、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM的溶液。离心浓缩具体方法为：取0.5 mL量子点溶液加入1.5 mL异丙醇经16000 rpm离心5 min，去除上清液，得到量子点沉淀，将多只离心后的量子点用0.5 mL1×PBS合并得到所需浓度。
分别向酵母菌中加入500μL不同浓度的CdTe量子点，使其终浓度分别为0μM 、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM的CdTe量子点，在30 °C、200rpm的摇床上培养1 h。
随后，将上述经由CdTe量子点处理的酵母菌分别转移至YPD培养基中，于30 °C下200 rpm的摇床上进行培养。每隔45 min取出500 μL留样进行吸光度的检测，共取5个试样，之后测定不同培养条件下酵母细胞在630 nm处的吸光度，绘制吸光度曲线，记录不同浓度下酵母细胞的生长情况。
2 结果与讨论
2.1 量子点的紫外-可见光谱和荧光光谱表征
0.400.350.300.25 15min 30min 1h 2h 3h 4h300250200intensity 15min 30min 1h 2h 3h 4hAbs0.200.150.10150100500.050.00400450500wavelength/nm5506000450500
550600wavelength/nm650700 图1不同反应时间下量子点紫外-可见光谱 图2 不同反应时间下量子点荧光光谱
由图1可以看出随着反应时间的增加，量子点的紫外吸光度越来越小，而荧光吸光度越来越大，但量子限域峰和荧光发射峰均有红移的趋势。 2.2 不同反应时间下量子点粒径和浓度的变化
由紫外-可见光谱得到的量子限域峰λ和荧光光谱得到的半峰全宽值fwhm计算得到量
子点的粒径、摩尔消光系数及量子点浓度如下表1。
表1 不同反应时间量子点的粒径及浓度
采样 时间 15min 30min 1h 2h 3h 4h
量子限 域峰λ 461 468 476 489 497 503
吸光度 Am 0.238 0.232 0.215 0.205 0.203 0.203
半峰全宽 值fwhm 38 38 44 42 43 44
粒径 D(nm) 0.838 0.938 1.527 2.009 2.258 2.424
摩尔消光 系数ε 6.901×103 8.779×103 2.463×104 4.407×104 5.649×104 6.566×104
吸光 度A 0.312 0.304 0.326 0.297 0.301 0.308
量子点浓度 c(μM) 45.190 34.628 13.246 6.737 5.328 4.691
图3、图4分别为不同反应时间下量子点的粒径和浓度的变化。由图3可以看出，随着反应时间的延长，量子点的粒径逐渐变大，但在反应后期变化较缓慢。由图4可以看出，随着反应时间的延长，量子点的浓度逐渐减小，在反应后期逐渐趋于稳定。出现该结果的原因为，在反应初始时量子点以较小粒径的形式存在，后逐渐聚集成较大的量子点，CdTe的总浓度一定但聚合度增加，表现出量子点的粒径增大而浓度减小。
2.62.42.22.01.8304050D/nm1.61.41.21.00.80.00.51.01.52.02.53.03.54.0c/?M2010time/h00.00.51.01.5
time/h2.02.53.03.54.0
图3 不同取样时间量子点的粒径变化 图4 不同取样时间量子点的浓度变化
2.3 反应4h时量子点的量子产率
在同一激发和发射狭缝（slit=5/3）条件下测得的CdTe量子点与罗丹明B的荧光光谱如图5所示。
对荧光峰面积积分可知：Fu=7685.2185、Fs=2125.2568，同时Au=0.07、As=0.01，罗
intensity200180160140120100806040 罗丹明B CdTe丹明B在水溶液中荧光量子产率Ys=89%；由公式Yu = Ys *(Fu*As)/(Fs*Au)可计算得到：反应4h后制得的CdTe量子点的荧光量子产率为45.98%。
2.4 Biomass法测定量子点的生物毒性
根据测定不同量子点浓度、不同培养时
200500550600wavelength/nm650700间下所取的酵母培养液的吸光度，以CdTe 图5 CdTe量子点与罗丹明B的荧光光谱
量子点浓度为0作为空白对照组，设空白对照组的酵母菌存活率为100%（其吸光度变化值为ΔA0），按照存活率=ΔA/ΔA0计算其他各组的酵母菌存活率，得到结果如表2所示。
表2 不同浓度量子点中酵母菌培养液吸光度变化
45min×0 45min×1 45min×2 45min×3 45min×4 ΔA 存活率(%)
0μM 1.029 0.881 0.906 1.474 1.867 0.838 100
2μM 0.912 0.929 1.388 1.305 1.418 0.506 60.4
4μM 0.662 0.959 1.102 1.294 1.398 0.736 87.8
8μM 0.767 0.473 0.891 1.127 1.262 0.495 59.1
16μM 0.801 0.594 1.069 1.232 1.364 0.563 67.2
32μM 0.791 0.726 1.356 1.300 1.372 0.581 69.3
图6为不同浓度量子点条件下酵母菌的生长曲线图。由图6可以看出，酵母菌最初吸光度基本为随浓度增大而减小的趋势，表明酵母菌初始浓度随量子点浓度增大而减小，即量子点浓度较大，对酵母菌生长的抑制更大，则最终酵母菌浓度也应该相对较小。图中吸光度随时间的规律性较不明显忽高忽低，可能由于取样过程中
Abs2.0 0?M1.81.61.41.21.00.80.60.40 2?M 4?M 8?M 16?M 32?M引入了杂菌，导致即使量子点毒化了部分酵母菌，但由于杂菌也在培养基中增殖，使得吸光度偏高。另外也可能由于取样时没有摇匀，导致量子点及大量的酵母菌沉淀在试管的底部而未被加入样品管中检测，使得吸光度
4590time/min135180偏低。 图6 不同浓度量子点中酵母菌生长曲线
3 结论
本文采用水热法合成了CdTe 量子点，量子产率为67%，并得到量子点的一系列性质随制备反应时间的变化关系图，主要是量子点粒径变化导致的一些光谱性质的改变。另外，通过与酵母菌的共培养得出量子点生物毒性随浓度的关系，忽略人为操作因素，可知量子点浓度越大毒性越强。
致 谢
感谢化学与分子科学学院田沺老师和吴卫兵老师对实验及仪器使用的指导和帮助。 感谢舒凡、刘林、章晓雯、柳慧颖和齐悦等同学的合作与帮助。
参考文献：
[1] Wu S. L, Dou J, Zhang J, et al. A simple and economical one-pot method to synthesize high-quality water
soluble CdTe QDs. J. Mate. Chem. 2012, 22 (29), 14573-14578.
[2] Yu W. W, Qu L. H, Guo W. Z, et al. Experimental determination of the extinction coefficient of CdTe, CdSe,
and CdS nanocrystals. Chem. Mater. 2003, 15 (14), 2854-2860.
[3] Xie M, Liu H. H, Chen P, et al. CdSe/ZnS-labeled carboxymethyl chitosan as a bioprobe for live cell
imaging. Chem. Commun. 2005, (44), 5518-5520.
Synthesis and Characterization of Water-soluble Quantum
Dots and Determination of Biotoxicity
WANG Jiaqi, SHU Fan, LIU Lin, ZHANG Xiaowen, QI Yue, LIU Huiying
(College of Chemistry and molecular sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract: Water - soluble CdTe quantum dots were synthesized with Cd(CH3COO)2·2H2O via one-step aqueous phase synthesis method which K2TeO3 as starting materials, NaBH4 as reductant and thioglycollic cid (TGA) as ligand. The products of different reaction time were characterized by UV-VIS spectroscopy and fluorescence spectroscopy, then calculated their size, concentration and fluorescence-quantum yield. The yeast cells were mixed cultured with the CdTe QDs of different concentration, and determining the biotoxicity of CdTe QDs by biomass method.
Key words: CdTe QDs; fluorescence-quantum yield; biotoxicity