三、研究方案
（一）总体学术思路和技术途径
本项目针对生产中存在的蔬菜商品品质和风味品质的突出问题，选取全基因组序列已经测定、常规育种基础好的大宗蔬菜白菜、甘蓝、黄瓜和番茄为研究对象，从与商品和风味品质密切相关的产品器官形成和风味物质代谢调控的生物学过程入手，深入蔬菜重要品质性状形成的遗传构成和基因调控机制，建立品质改良的全基因组分子设计的理论和方法体系，创制优质新材料，培育优质新品种，力图实现“从基因组到品种”的整体构想。
针对品质性状形成遗传构成的关键科学问题（科学问题1），在基因组框架图的基础上，利用核心资源和现有主要亲本重测序数据，构建全基因组遗传变异图谱；结合对重要品质性状的详细调查和分析，确定控制叶球形成、果实形成和风味形成的关键遗传位点；结合图位克隆、候选基因分析、突变体分析和转基因验证等技术手段，分离和鉴定品质性状形成的关键基因，回答哪些基因控制了品质性状形成的科学问题。
针对品质性状形成基因调控机制的关键科学问题（科学问题2），选择已经详细鉴定过表型的自然和人工突变体以及转基因材料，对叶球和果实的不同发育阶段以及不同环境条件下的转录组（包括小RNA）进行分析，从全基因组水平确定与关键基因共表达或者反向表达的基因集，构建关键基因的表达网络；不少已经发现的形态建成基因是转录因子，项目将确定参与叶球和果实形成转录因子的下游受控基因；通过酵母双杂交等技术手段确定与关键基因有蛋白互作的基因；通过突变体的遗传分析，确定关键基因的上下游基因，确定其信号传导途径；分析风味形成基因参与的代谢网络；综合上述分析手段，探明叶球和果实形成和风味物质代谢的基因调控机制。
利用上述研究中关键基因的序列开发前景选择分子标记，为现有主要亲本的定向品质改良提供选择工具；利用全基因组遗传变异图谱开发背景选择SNP芯片，用于在育种中保持现有主要亲本的良好遗传背景；并且将这套全基因组分子设计的技术体系应用在优质新品种培育的实践上，实现“从基因组到品种”的战略构想。
上述研究将为蔬菜品种改良的国家支撑计划和“863”等科技计划的顺利实施提供依据与支撑，为蔬菜学学科体系的发展提供新理论、新技术与新方法。
总体学术思路和技术途径如下图（图1）所示：
图1. 总体学术思路与主要技术途径
（二）创新点与特色
（1）以国家重大需求为导向：本项目以大面积种植的白菜、甘蓝、番茄和黄瓜为主要研究对象，针对生产中亟待解决的未熟抽薹、裂球裂果、风味不佳等商品和风味品质问题，紧密围绕产品器官形成和风味物质代谢的遗传构成和基因调控机制的关键科学问题，进行深入的研究。这些均属推动优质蔬菜品种国产化、实现产业转型升级中亟待解决的重大科学问题，体现了国家的重大需求。
（2）以多基因控制品质性状的遗传构成为科学突破口：蔬菜的商品和风味品质性状是由多基因控制的，其遗传构成的问题是蔬菜学科多年来没有得到有效解决的难题。人类复杂疾病的研究表明，基因组序列是解析复杂性状遗传的必须工具。在本项目研究的四种蔬菜中，黄瓜、白菜和甘蓝的基因组框架图都是由项目申请单位主导完成的，并且也基本完成了核心资源的重测序工作，这使得本项目团队在研究蔬菜品质性状遗传构成上取得了先机，有可能实现重大突破。
（3）以叶球形态建成的基因调控机制为理论突破口：以往对植物的研究大多以拟南芥和水稻等模式植物为实验材料，蔬菜作物产品器官的形态和生理特性与模式植物有很大区别，其遗传基础和基因表达调控的机制有其自身的特点。前期研究发现一批新的与白菜叶球形态建成有关的miRNA和功能基因，本项目将在基因组框架图的基础上，对miRNA的靶标位点和已知功能基因的表达调控网络进行新颖细致的分析，提出叶球发育遗传调控的新理论。
（4）以假说和数据联合驱动为科学方法论：生物学研究主要依赖假说驱动的科学方法论，即根据已有的知识建立工作假说、设计实验加以验证。测序技术的飞速发展导致海量基因组（包括基因组、转录组、甲基化等）数据的产生，数据驱动的科学方法论（通过生物信息学寻找基因组数据自身的规律）将发挥更大的辅助作用。两种方法论的互补将导致大量的科学发现，这一点在现代物理学研究中已经得到验证。在本项目中将采用假说和数据联合驱动的科学方法论，研究内容1主要通过基因组数据和表型数据进行关联分析，属于数据驱动；研究内容2主要通过对叶球和果实形成以及风味物质代谢的已有知识进行总结和归纳，提供新的工作假说，进行验证，属于假说驱动。两种方法论穿插交织在整个研究过程中，将会得到新的科学发现。
（5）以“从基因组到品种”为产业突破口：DNA测序成本的快速降低为农业基因组学的研究和应用带来历史性的机遇，如何利用基因组学的方法手段加快育种进程是目前农业科研界面临的共同难题。本项目在主要蔬菜全基因组测序已经完成的基础上，将前沿的基因组学及生物信息学与蔬菜育种实践紧密联系起来，利用白菜、黄瓜和番茄等蔬菜生命世代短（3－4个月）和国内遗传育种基础较好的优势，开发品质改良的全基因组分子设计技术体系，培育优质新品种, 为产业转型升级提供科学和技术支撑。
（三）取得重大突破的可行性分析 （1）研究目标明确，立论依据充分
围绕国家重大需求和学科前沿，瞄准蔬菜品质育种必须解决的两大基础科学问题，开展本项研究。借鉴了国内外大田作物和模式生物研究多基因控制性状的最新成果和进展，具有
可靠的立论依据。
（2）研究材料完备，方法成熟先进
项目申请单位是国家蔬菜种质资源中期库的依托单位，拥有近一万份白菜、甘蓝、黄瓜和番茄种质资源，前期已经对资源进行初步的品质性状调查，从中发掘和培育出一批具备优异品质性状的种质资源，并已构建了各种分离群体（包括近等基因系、重组自交系群体等），黄瓜和番茄的突变体群体也基本完成，为后续遗传分析和基因鉴定带来了很大的便利。项目综合采用基因组学、生物信息学、群体遗传学、分子生物学等学科的最新技术，方法成熟、先进。
（3）研究基础坚实，队伍精干合理
项目团队先后组织完成了黄瓜、白菜和甘蓝基因组测序，并参与了番茄基因组测序，基本确立了我国在蔬菜基因组学领域的暂时领先地位。基因组学的优势为我国在蔬菜分子遗传学的发展打下了很好的基础，先后构建了多张蔬菜分子标记连锁遗传图谱，其中黄瓜图谱是葫芦科首张遗传－细胞遗传整合图谱，包含近1000个SSR标记。项目团队已经分离鉴定或精细定位了多个蔬菜产品器官形成和风味代谢的关键基因。实现了不同学科的交叉和融合，集中了中国农业科学院、中国科学院、上海交大、中国农大、南京农大等相关重点科研院校在本领域的优秀人才，组成了精干、高效、务实的研究团队，为本项目的顺利完成提供了人才保障。团队配置体现了“从基因组到品种”整体构想的需要，既有从事基因组学和分子生物学的中青年科技骨干，也有具备多年田间实践经验的育种专家。 （4）支撑体系强大，国际合作密切
依托国家蔬菜改良中心和4个密切相关的国家重点实验室及多个部门重点开放实验室，拥有较好的研究条件和设备，为本项研究提供了坚实的物质基础。“十一五”期间，项目主持单位主办了多次葫芦科和十字花科基因组国际研讨会，在蔬菜基因组学领域具有广泛的国际影响。例如，2008年11月举办的“国际葫芦科基因组学和生物学会议”吸引了美国康奈尔大学、威斯康星大学、西班牙农科院、日本蔬菜茶叶研究所、澳大利亚多态性芯片技术中心等多家知名大学和科研机构参加。这些学术活动一方面能及时获取国外最新学术思路、技术和资源，另一方面为国际合作奠定基础，获得一批有重要理论和应用价值的成果。2013年项目申请单位（中国农业科学院和中国科学院遗传与发育生物学研究所）将举办“国际茄科基因组大会”，估计将有200多名国际同行和300多名国内同行参加。这种密切的国际合作为本项目的研究提供了国际视野，也提升了我国科学研究在国际的影响力。
（四）课题设置
基于项目拟达到的总体目标，以“蔬菜商品和风味品质性状形成的遗传构成和基因调控机制”的关键科学问题为切入点，共设置6个研究课题。
课题1 蔬菜品质性状全基因组关联分析
蔬菜品质性状是多基因控制性状，而全基因组关联分析（GWAS）是研究多基因性状的有力手段。全基因组遗传变异图谱，是GWAS的必需“蓝图”。本课题重点开展以下研究： 1． 主要研究内容
种质资源品质性状的观察分析：对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄种质资源的品质性状，包括白菜和甘蓝的结球习性和紧实度、未熟抽薹和裂球率，黄瓜瓜把长度、畸形果率，番茄果实形状、大小、畸形果率、裂果率，黄瓜果实苦味和清香味等风味物质的化学成份等，进行观察测定。
全基因组遗传变异图谱构建：在白菜、甘蓝、黄瓜、番茄的全基因组序列基础上，利用不同种质资源的重测序数据，定位所有SNP位点和结构变异位点（Structural variation, SV），确定全基因组范围内的连锁不平衡区块。
全基因组关联分析： 在性状调查和全基因组变异图谱的基础上，通过关联分析，确定白菜、甘蓝叶球的形态建成、黄瓜和番茄果实的形态建成，以及黄瓜苦味和清香味物质代谢的关键遗传位点。 2. 研究目标
创建白菜、甘蓝、黄瓜和番茄的全基因组遗传变异图谱，包含至少100万个SNP标记和5万个SV标记，确定控制叶球、果实形成、风味物质代谢的关键遗传位点，为关键基因的分离和鉴定提供候选基因。
课题承担单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京师范大学 浙江大学 课题负责人：黄三文研究员
学术骨干：林魁，曹家树，张忠华， 程峰 经费比例：18.6%
课题2 蔬菜品质性状形成关键基因的分离与鉴定