课题6 主要蔬菜品质改良的全基因组分子设计
充分利用上述各研究课题的成果，开发可用于对蔬菜商品品质和风味品质进行综合改良的分子标记辅助选择工具和育种程序，是实现本项目基础研究成果转化为实用技术的关键。本课题以白菜、甘蓝、黄瓜和番茄为对象，进行分子育种工具与技术的开发。重点开展如下研究：
1．主要研究内容
高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物重测序数据库和功能基因组分析信息，筛选一批稳定可靠的分子标记，使用Illumina芯片系统或其它先进标记检测系统开发一套稳定、高效的高密度分子标记检测体系。以此为基础，通过对核心育种材料的分析，筛选出多态性丰富、检测稳定、在基因组中分布均匀的SNP、InDel或SSR等标记，用于追踪优良亲本背景。
前景选择标记系统开发：针对白菜/甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物，应用高密度分子标记检测方法，进行重要品种资源和特定遗传群体分析，筛选出适于如下三个方面性状筛选的前景选择标记：1）白菜/甘蓝耐抽薹性、富含有益硫甙、早熟性和根肿病抗性；2）黄瓜果实刺瘤的有无、果皮的薄厚、果把长短、种子腔直径、苦涩、清香味、抗霜霉病、抗白粉病选择的前景标记；3）番茄果实大小、皮薄厚、固形物多少。
品质改良全基因组分子育种策略研究：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜品质性状在自交、回交、杂交和复交等不同分离群体中分离规律。建立通过分子标记进行前景和背景选择高效聚合分散在不同亲本材料中的大量目标基因的育种策略与技术方案。
优质新材料创制和优质新品种培育：在实际育种过程根据全基因组分子设计，针对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄商品品质和风味品质进行综合改良，获得一批耐抽薹和抗裂球的、高产抗病的白菜和甘蓝新材料和新品种，获得一批果形好、清香味浓、无苦味的、高产抗病的黄瓜新材料和新品种，获得一批抗裂果、畸形果率低、高产抗病的番茄新材料和新品种。 2．预期研究目标
构建高效的前景与背景筛选系统，建立品质改良的全基因组分子设计理论和方法体系；对现有主要亲本的品质性状缺陷进行改良，创制40份优质新材料，培育出5～8个优质新品种或组合。
课题承担单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京市农林科学院蔬菜研究中心 课题负责人：王晓武研究员
学术骨干：方智远院士，杜永臣，孙日飞，顾兴芳，张凤兰 经费比例：18.6%
（五）课题间相互关系
本项目的各项研究是在研究对象－白菜、甘蓝、黄瓜和番茄基因组框架图已经构建完成的基础上进行，将充分利用基因组资源对两个科学问题（遗传构成和调控机制）进行深入研究，并构建品质性状分子改良的技术基础（图2）。由于蔬菜作物不同品质性状的遗传构成研究具有共性，设置全基因组关联分析（课题1）和关键基因分离鉴定（课题2）两个课题，关联分析所确定的关键遗传位点是关键基因克隆的基础；在基因调控机制的研究上，叶球形成属于营养器官的发育过程（课题3），果实形成属于生殖器官的发育过程（课题4），而风味形成属于次生代谢过程（课题5），各俱特色，因此各设定一个课题深入研究；两个科学问题的研究之间也有很多信息的交互。承接前5个课题的科学发现，开发前景选择和背景选择技术平台，建立品质改良的全基因组分子设计的理论和方法体系，预期将产出新育种技术、新育种材料和新优质品种（组合）。
图2. 课题设置及其关系
四、年度计划
研究内容 1. 种质资源品质性状调查和测定，构建品质性状表型数据库。 2. 筛选种质资源材料和亲本材料，准备重测序。 3. 白菜和甘蓝叶球形成不同时期的基因表达谱分析；甘蓝叶球形成相关基因的筛选；白菜和甘蓝抽薹开花关键基因的克隆与MIKC结构域等生物信息学分析。 4. 分离与大白菜叶球形态发生和未熟抽薹有关的基因和表观遗传因子。 5. 生长素和细胞分裂素等内源激素对叶卷曲和叶球形态发生进程的影响。 6. 大白菜中过表达或沉默几个重要的miRNA或靶基因。 第 一 年 7. 大白菜叶卷曲和叶球形成的纯合突变体基因芯片分析和转录组分析。 8. 利用黄瓜遗传群体，对黄瓜瓜把长短和果肉厚度进行精细定位。 预期目标 1. 构建完成白菜、甘蓝、黄瓜和番茄的种质资源品质性状表型数据库。 2. 进一步的重测序准备工作完成。 3. 获取叶球形成和展开不同时期甘蓝基因表达谱；分析差异表达基因，筛选出叶球形成相关基因。获得白菜和甘蓝抽薹关键基因序列及其结构域等生物信息。 4. 筛选10个以上控制叶卷曲和叶球形成相关基因的候选基因，确定不结球、裂球、未熟抽薹的纯合基因型，建立2-3个基因芯片和转录组分析的数据库。 5. 初步完成黄瓜的瓜把长短和果肉厚度等性状的精细定位。 6. 得到黄瓜瓜形调控关键基因的关联分析、分离与鉴定的初步结果。 7. 筛选获取黄瓜Tu候选基因，共分离标记验证。 8. 明确黄瓜单性结实性状的遗传特征. 9. 在黄瓜上对 HAN，CLV1， CLV3，YODA，ANT进行同源克隆；利用9. 完成黄瓜苦味形成基因的精细定位。RT-PCR和RNA原位杂交等技术，分获得黄瓜清香味物质代谢途径中的关析果形相关基因的时空表达特性。 键基因序列。 10. 通过比较初步确定黄瓜果瘤Tu候选基因，开发共分离标记，并进行Tu候选基因的功能分析。 11. 黄瓜单性结实遗传群体构建及遗传规律分析。 12. 黄瓜苦味形成基因的精细定位。克隆黄瓜LOX，ADH，HPL等清香味物质合成相关基因。 13. 构建分离群体，对番茄黄果形成基因r进行精细定位，对紫果形成基因（未知基因）和高番茄红素含量基因（未知基因）进行初步定位。 14. 在番茄上精细定位番茄RG和PST基10. 完成对番茄r基因精细定位及控制紫果、提高番茄红素含量基因的初步定位工作。 11. 确定番茄rg位点的精确染色体区域；获得pst候选基因及其突变位点。 12. 摸索建立适合黄瓜化学物质分析的方法体系，初步完成黄瓜特异化合物数据库的建立（包括定性定量的信息），获得3-5个黄瓜苦味物质葫芦素形成关键结构基因并进行体外生化分析。 13. 高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：针对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄，每种作物筛选不少于1536个
研究内容 因，确定PST候选基因及其突变位点；完善RG和PST基因的NILs构建。 15. 对具有不同代表性的黄瓜品种进行全面的化学物质分析；克隆和分析黄瓜苦味物质葫芦素形成关键结构基因和转录因子序列。 16. 高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物重测序数据库和功能基因组分析信息，筛选出多态性丰富、在基因组中分布均匀的SNP、InDel或SSR等标记。 17. 前景选择标记系统开发：1）白菜耐抽薹性；2）甘蓝叶球颜色；3）黄瓜果实苦味和果实光泽；4）番茄果实大小。 1. 完成筛选材料的重测序，挖掘SNP和SV等遗传变异位点，连锁不平衡分析确定连锁遗传区域，并构建全基因组遗传变异图谱。 2. 利用表型数据和遗传变异图谱进行全基因组关联分析，确定控制品质性状的关键遗传位点和候选基因。 3. 甘蓝和白菜叶球形成相关基因的克隆及其与叶球形成相关性分析；控制抽薹开花关键基因的相互作用原核验证。 预期目标 SNP、InDel或SRR标记，标记分布均匀。 14. 前景选择标记系统开发：1）白菜：开发3个耐抽薹主效关键基因选择标记；2）甘蓝：开发叶球颜色的选择标记，遗传距离小于5cM；3）黄瓜：开发果实无苦味和有光泽选择标记，遗传距离小于5cM；4）番茄：开发番茄果实大小，与目标基因连锁距离小于2cM。 1. 构建全基因组遗传变异图谱，SNP和SV标记数目分别大于100万和5万个。 2. 为每个性状确定3-5个关键遗传位点，并为每个位点确定30个以下候选基因。 3. 检测结球、不结球和结球不紧实甘蓝突变体内基因表达情况，分析基因表达的差异，结合上述分析确定叶球形成关键基因的目标基因。获得抽薹开花关键因子的原核表达蛋白相互作用体系。 第 二 年 4. 分离大白菜中与叶球形成相关的4. 鉴定3－5个控制叶球商品品质的关键miRNA，并进行过表达或沉默研究。 基因，搞清楚2-3个调控叶球发育相关基因的生物学功能，揭示不结球、未5. 黄瓜瓜把长短和果肉厚度的精细定熟抽薹的遗传基础。 位，结合课题1的基因组关联分析，筛选和预测目标基因的候选基因。 5. 精细定位黄瓜瓜把长短和果肉厚度QTL。 6. 分析黄瓜瓜形调控关键基因的时空表达特性，对这2-4个关键基因进行6. 完成黄瓜Tu候选基因的表达模式分TILLING突变体库的筛选，构建这析，初步完成其遗传转化。 2-4个关键基因的过量表达和RNAi7. 解析黄瓜瓜形调控关键基因的时空表诱导缺失突变的载体。 达特性, 挑选出2-4个对黄瓜瓜形起7. 黄瓜果瘤Tu候选基因的转基因功能关键调控作用的候选基因。对候选的验证。 关键基因进行TILLING突变体库的筛选;构建关于候选关键基因的过量表8. 黄瓜单性结实性状的主效QTL定位，达和RNAi诱导缺失突变的载体。 并进行黄瓜单性结实果实发育的转录