白质部分稳定结合。
血红蛋白（hemoglubin，Hb）具有4个亚基组成的四级结构（图 2－16），每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。共结合4分子氧。成年人红细胞中的地主要由两条α肽链和两条β肽链（αβ）组成，α链含141个氨基酸残基，β链含146个氨基酸残基。胎儿期主要为αγ，胚胎期为αε。Hb各亚基的三级结构与 Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键（图2－21），使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。
〔二〕血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与 Mb一样可逆地与O2结合，氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。图2-22为Hb和Mb的氧解离曲线，前者为S状曲线，后者为直角双曲线。可见，Mb易与O2结合，而Hb与O2的结合在O2分压较低时较难。Hb与O2结合的S型曲线示Hb的4个亚基与4个O2结合时平衡常数并不相同，而是有4个不同的平衡常数。Hb最后一个亚基与O2结合时其常数最大，从S型曲线的后半部呈直线上升可证明此点。根据S形曲线的在。特征可知，Hb中第一个亚基与O2结合以后，促进第二及第三个亚基与O2的结合，当前三个亚基与O2结合后，又大大促进第四个亚基与O2结合，这种效应称为正协同效应（positive cooperativity）。协同效应的定义是指一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则称为正协同效应；反之则为负协同效应。
根据Perulz等利用x线衍射技术分析Hb和氧合Hb结晶的三维结构图谱，提出了解释O2与Hb结合的正协同效应的理论。
未结合O2时，Hb的α/β和α/β呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（tense state,T态），T态Hb与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，其二级、三级和四级结构也发生变化，使α/β和α/β的长轴形成15”的夹角（图2一23），结构显得相对松弛，称为松弛态（relaxed State，R态）。图 2－24显示 Hb氧合与脱氧时T态和R态相互转换的可能方式。T态转变成R态是逐个结合O2而完成的。在脱氧Hb中，Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，因此Fe2+高出卟琳环平面0．075nrn，而靠近F8位组氨酸残基。当第1个O2与血红素Fe2+结合后．使Fe2+的半径变小，进入到卟啉环中间的小孔中（图2－25），引起F肽段等一系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象，造成两个α亚基间盐键断裂，使亚基间结合松弛，可促进第二个亚基与O2结合，依此方式可影响第三、四个亚基与O2结合，最后使四个亚基全处于R态。此种一个氧分子与 Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构效应（allosteric effect）。小分子O2称为变构剂或效应剂，Hb则被称为变构蛋白。变构效应不仅发生在Hb与O2之间，一些酶与变构剂的结合、配体与受体结合也存在着变构效应，所以它具有普遍意义。系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象。
第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化
蛋白质既然由氨基酸组成，其理化性质必然与氨基酸相同或相关，例如，两性电离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等。但蛋白质又是生物大分子化合物，还具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。细胞和体液中蛋白质都是数以百万计相混合，要分析单个蛋白质的结构和功能势必先要分离纯化蛋白质。蛋白质分离通常就利用其特殊理化性能，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构与功能的需要。
一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和氨基可解离外，侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的γ和β—羧基，赖氨酸残基中的ε—氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基，在一定的溶液水条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电行，反之则带正电荷。 体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于 pH5 .0所以在人体体液 pH 7．4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质含碱性氨基酸较多，其等电点偏于碱性，被称为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等。也有少量蛋白质含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白等。 （二）蛋白质的肢体性质
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的颗粒大小可达l
－100nm胶粒范围之内。蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。除水化膜是维持蛋白质胶体稳定的重要因素外，蛋白质胶粒表面可带有电荷，也可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶粒两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
蛋白质的三级结构主要依赖于氨基酸残基R之间的相互作用，从而保持蛋白质的天然构象。但在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。蛋白质变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。在医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外，防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。
蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出，这一现象被称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation）。图2－17所示，在核糖核酸酶溶液中加入尿素和β一巯基乙醇，可解除其分子中的4对二硫键和氢键，使空间构象遭到破坏，丧失生物活性。变性后如经透析方法去除尿素和β巯基乙醇，并设法使巯基氧化成二硫键，核糖核酸酶又恢复其原有的构象，生物学活性也几乎全部重现。但是许多蛋白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。
蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用（protein coagulation）。实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。 （四）蛋白质的紫外吸收
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。在此波长范围内，蛋白质的O．D．280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
(五)蛋白质的呈色反应 1．茚三酮反应（ninhydrin reaction）蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，详见本章第一节。
2．双缩脲反应（buret reaction）蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双绩豚是色的深度就逐渐下降，因此双缩腺反应可检测蛋白质水解程度。
二、蛋白质的分离和纯化 （－）丙酮沉淀及盐析
这是两种常用的使蛋白质从溶液中沉淀的方法。蛋白质在溶液中一般含量很低，经沉淀浓缩，以利进一步分离纯化。使用丙酮沉淀时，必须在0－4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
盐析（salt precipitation）是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。各种蛋白质盐折时所需的盐浓度及pH均不同。例如血清中的白蛋白及球蛋白，前者溶于 pH 7．0左右的半饱和的硫酸铵溶液中，而后者在此溶液中沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时，白蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离，不过欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动，这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳（electrophoresis）。根据支撑物的不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄
膜两端分别加正负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酸胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，两端加上正负电极，蛋白质即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到一条条已被分离的蛋白质色带。 （三）透析
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析（dialysis）。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成。微孔一般只允许分子量为 10 000以下的化合物通过。蛋白质是高分子化合物故留在袋内。当透析袋内盛有蛋白质溶液，再置于水中，则小分子物质如硫酸铵、氯化钠等即透过薄膜。不断更换袋外的水，可把袋内小分子物质全部去尽。如果袋外放吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质逐出袋外，袋内蛋白质溶液尚可达到浓缩的目的。 （四）层析
层析（chromatography）是蛋白质分离纯化的重要手段之一。层析种类很多，有离子交换层析。亲和层析等。其中离子交换层析应用最广。蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离（图2-26）。
图2－26介绍的是阴离子交换层析，将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子（图2-26a）。然后再用含阴离子（如 －
Cl）的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（图 2-26b），增加 Cl浓度。含负电量多的蛋白质也被洗脱下来（图2-26C），于是两种蛋白质被分开。 （五）分子筛
又称凝胶过滤（gel filtration），是层析的一种，层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进人孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离（图2-27）。
（六）超速高心 超速离心法（ultracentrifuation）既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在高达50万g（g为gravity，即地心引力）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力（buoyant force）与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示，系数与蛋白质的密度和形状相关（表2－3）。
dx／dt代表颗粒在离心场中的移动速率，。为离心头的角速度，X是距转动中心的距离，
-13
t为离心时间。沉降系数（S）使用Svedberg单位（1S＝10秒）。
应用超速离心法测定蛋白质分子量时，一般用一个已知分子量的标准蛋白质作为参照，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，它的计算式如下： 这一算式对多数球状蛋白质都适用，但大多数纤维状蛋白质由于其分子形状的高度不对称性，无法使用上述简单算式。
三、多肽链中氨基酸序列分析
自从1953年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。当年Sanger花费多年才基本搞清胰岛素的一级结构，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有数万种蛋白质的氨基酸序列问世。当今的分析原则基本借用Sanger提出的方法，但具体方法已有很大改进。首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成、蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数（图2－28）。第二步测定多肽键的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基，即肽链头、尾的氨基酸残基。Sanger当年用二硝基氟苯与多肽链的α一氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酸衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将羧基端氨基酸残基水解下来。当鉴定了头、尾两端的氨基酸残基以后，此二头可作为整条肽链的标志点（表2-4）。
第三步是把肽链水解成片段，分别进行分析。方法甚多，常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳
蛋白酶法、溴化氰法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。
胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙、酪及色氨酸）羧基侧的肽键，溴化睛水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。由水解生成的肽段，可用离子层折或其他层析方法将其分离纯化；如用双向纸电泳，可以得到肽图（图2－29），由此明了肽段的多少。
然后测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法。肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基末端氨基酸的游离α一氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基末端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用。如是逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图2-30）。
如前所述，一条多肽链可被水解成若干片段，图2-29中，已被水解成27个片段。这些肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸顺序测定。但是获得了这些数据之后，还不能得出整条多肽键的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的前后次序。一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。兹举一个12肽为例以说明之。在实际工作中一个12肽在自动氨基酸顺序仪上就可测出氨基酸序列，不必经过酶解等步骤。经上述3种降解处理，获得8种肽段，根据它们的重复顺序排列，就可以正确地作出12肽的氨基酸排列顺序。 近年来，由于核酸的研究在理论上及技术上的迅猛发展，人们开始通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列。蛋白质中的氨基酸顺序是从信使RNA（mRNA）中核苷酸序列翻译过来的，因此只要找到相应的mRNA测出它的核苷酸顺序，氨基酸序列也就清楚了。此方法先分离编码蛋白质的基因，测定DNA序列，排列出mRNA序列，按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列。目前多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此方法而获知的。 四、蛋白质空间结构测定 蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大。目前已知氨基酸序列的蛋白质多达20万个，而测得其空间结构仅8000个左右。通常采用X射线晶体衍射法（X一ray diffraction），首先将蛋白质制备成晶体。迄今为止，并非所有纯化蛋白质都能制备成满意的能供三维结构分析的晶体。例如糖蛋白，由于蛋白质分子中糖基化位点和某些位点的糖链结构存在不均一性，很难获得糖蛋白的晶体。X射线射至蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射，X线片则接受衍射光束，形成衍射图。这种行射图也即X射线穿过晶体的一系列平行剖面所表示的电子密度图。然后借助计算机绘制出三维空间的电子密度图。如一个肌红蛋白的衍射图有 25 000个斑点，通过对这些斑点的位置、强度进行计算，已得出其空间结构。此外，近年建立的二维磁共振技术，也已用于测定蛋白质三维空间结构。 由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，近年来根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构，受到科学家的关注。预测蛋白质空间结构的方法主要有两类。第一类方法是采用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。第二类方法是通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。
小结
蛋白质是生物大分子，在体内分布广泛，含量丰富，种类繁多。每一种蛋白质都有其特有的生物学功能。
蛋白质的基本组成单位是α一氨基酸，有20种。氨基酸属于两性电解质，在溶液的pH等于其pI时，氨基酸呈兼性离子。氨基酸可通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，反之则称为多肽。体内存在许多如 GSH、促甲状腺释放激素和神经肽等重要的生物活性肽。
根据蛋白质的形状，可分成球状蛋白质和纤维状蛋白质。根据组成成分，还可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，前者仅含有氨基酸，后者除氨基酸外，还含有非蛋白质的辅基成分。复杂的蛋白质结构可分成一级、二级、三级和四级结构四个层次。蛋白质一级结构是指蛋白质分子中氨基酸自N端至C端的排列顺序，即氨基酸序列，其连接键为肽键，还包括二硫键。形成肽键的6个原子处于同一平面，构成了所谓的肽单元。二级、三级和四级结构研究蛋白质的空间构象，分层次阐述蛋白质的三维立体结构。二级结构是指蛋白质主链局部的空间结构，不涉及氨基酸残基侧链构象。主要为α一螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲，以氢键维持其稳定性。在蛋白质中，存在二个或三个具有二级结构的肽段所形成的特殊空间构象，
称为模序，发挥着特殊的生物学功能。三级结构是指多肽链主链和侧链的全部原子的空间排布位置。三级结构的形成和稳定主要靠次级键。一些蛋白质的三级结构可形成1个或数个球状或纤维状的区域，各行其功能，称为结构域。四级结构是指蛋白质亚基之间的缔合，也主要靠体级键维系。
体内存在数以千万种蛋白质，各有其特定的结构和特殊的生物学功能。一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象及功能也相近。若蛋白质的一级结构发生改变则影响其正常功能，由此引起的疾病称为分子病。
蛋白质空间构象与功能有着密切关系。血红蛋白亚基与O2结合可引起另一亚基构象变化，使之更易与q结合，所以血红蛋白的氧解离曲线呈S型。这种变构效应是蛋白质中普遍存在的功能调节方式之一。蛋白质的空间构象发生改变，可导致其理化性质变化和生物活性的丧失。蛋白质发生变性后，只要其一级结构未遭破坏，仍可在一定条件下复性，恢复原有的空间构象和功能。
分高纯化蛋白质是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。
（查锡良）