DNA印迹原理：用合适的限制性内切酶消化DNA，电泳分离DNA片段，利用毛细作用，使液体经过凝胶，使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面（NCM），然后进行杂交。 作用：检测待定基因的大小、拷贝数、变异等。 步骤：DNA的抽提、质量检测；限制性内切酶操作；DNA的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4N NaOH变性；转膜（毛细管渗吸或电转移）；80℃处理或紫外线照射将DNA固定在膜上；探针制备、检测等。
应用/意义：①特定基因定性定量检测；②基因突变分析；③酶切图谱分析；④基因重排和丢失检测。 Northern blotting
步骤：RNA(mRNA)提取，限制性内切酶消化，变性凝胶电泳分离RNA片段，转膜，预杂交，杂交，放射自显影。应用：RNA的定性定量研究，mRNA表达高低，癌基因、抑癌基因活化。 补充： southwestern blotting：该方法结合了western blot和Southern blot两种试验方法而发展起来的检测与特意DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法。基本原理：细胞核蛋白提取物经过SDS-PAGE后，转移至NCM上，然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。
Immunochemistry：基本原理：应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。 ? PCR基本工作原理？反应三步骤？应用？在医学上具体应用？成败的关键因素？
PCR聚合酶链反应：又叫无细胞分子克隆、体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。 PCR基本原理：是以体外酶促反应的方式，模拟天然的DNA复制过程。以待扩增DNA片段为模版，根据其5’-3’端的核苷酸顺序，设计一对与之互补的寡核苷酸为引物，模版DNA高温变性解链，低温退火，引物与摸板DNA单链的互补顺序结合，中温条件下，通
过Taq DNA聚合酶作用，以四种dNTP为原料，单链DNA模版逐步延伸，合成新的DNA互补链。这样的三步反应为一个周期，每一周期产物又可作为新模板进行新的合成反应。n次循环后，拷贝数增加2n倍。一般经过25~30个循环，拷贝数可扩增上百万倍。经过电泳、染色，可直接观察待测基因存在与否，不需要与基因探针分子杂交。 常见几种PCR：逆转录PCR（RT-PCR）；巢式 PCR；RACE；反向PCR；定量PCR--real time PCR；半定量PCR。 PCR的基本反应步骤：高温变性、低温退火、中温延伸。
① 高温变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链变成单链；
② 低温退火/复性：降低温度至37~56℃（Tm-5℃）使引物与模板DNA单链结合；
③ 中温延伸：将温度升至72℃，Taq DNA聚合酶以dNTP为底物，催化合成一条与模板互补的新链（在引物3’端进行延伸），使原模板DNA的一条链变成两条链。 PCR应用：扩增基因，cDNA文库及筛选，直接测序，染色体特异区带片段克隆，检测突变，简并引物扩增未知序列，标记探针。
医学上具体应用：病原体的检测，遗传病基因诊断，肿瘤相关基因诊断，组织配型，法医、亲子鉴定。 成败的关键因素： ? 实时PCR/荧光定量PCR？原理？优点？与普通PCR的不同及优势？ Realtime PCR/实时PCR/荧光定量PCR：是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对位未知的模板进行定量分析的方法。 原理： 1、在Taqman寡核苷酸探针的5’端标记一个报告荧光染料，3’端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料发射的荧光信号被猝灭染料吸收→不发光。
2、PCR产物扩增时，Taq酶遇到了结合在模板上的Taqman寡核苷酸探针，其5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告染料与猝灭染料分离，荧光共振能量转移不再发生，报告荧光发射的荧光强度与被切掉的
探针成正比。实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，由此可以计算PCR产物的含量。
3、如果用相同模板量的不同样本进行Taqman PCR扩增时，相同时间分析荧光强度可以发现产物含量的差异，这实际上是基因模板含量不同所致，由此可以推测基因拷贝数的变化情况。
优点：准确定量结果；特异性更高；闭管操作防止污染；全自动化反应、数据收集和分析；无需凝胶电泳；高通量；阳性内参照防止假阴性结果。 ? 基因治疗的主要策略？步骤？ 基因治疗：是指从DNA水平所采取的一切治疗措施和新技术。例如向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷；或采用特定方式关闭、抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。
途径：生殖细胞基因治疗（存在伦理学障碍，不考虑人类）；体细胞基因治疗（主要是转基因治疗）。 主要策略：
1、 基因标记：解决：①外源基因能否安全转移到患者体内；②从患者体内取出的细胞能否检测到转移基
因的存在。
2、 基因置换/矫正：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列。 3、 基因添加：导入外源基因，使靶细胞表达其本身不表达的基因。
4、 基因干预：是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治 疗疾病的目的。基因干预的主要方法：①反义RNA；②RNAi；③核酶裂解特异的靶mRNA；④三链DNA。 基因治疗的步骤：①克隆治疗基因；②选择合适靶细胞；③通过载体将治疗基因导入靶细胞；④目的基因在受体细胞内的有效表达。 ? 癌基因？抑癌基因？激活机制？癌基因与肿瘤发生的关系？
癌基因：细胞基因组中具有能使正常细胞发生恶性转化的基因，称为癌基因。癌基因是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，在癌基因异常表达时，其产物可使细胞无限分裂。 抑癌基因/抗癌基因/肿瘤易感基因/隐性癌基因：是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。
在正常细胞的增殖调控信号中，原癌基因起正调控作用，抑癌基因起负调控作用，抑制细胞增殖，促进细胞成熟，朝向终末分化和凋亡，维持基因稳定。 原癌基因激活机制：
1. 原癌基因点突变：原癌基因的表达产物多有促进细胞增殖的功能，当点突变发生后：①该蛋白质的活性可大大增强，对细胞增殖的刺激作用也增强；②该蛋白质的稳定性可能增加，导致其在胞内浓度增加，对增殖刺激的时间和强度也随之增加；③可能会引起RNA的错误剪接而改变蛋白质的结构与功能。 2. 原癌基因获得启动子与增强子； 3. 原癌基因扩增：原癌基因通过某些机制在原染色体上复制出多个拷贝→表达产物异常增多→加速细胞增殖。 4. 原癌基因移位或重排：癌基因从所在染色体的正常位置易位到另一染色体的某一位置上，使其调控环境发生改变，从相对静止状态转为激活状态。 ? 基因工程的操作过程？/重组DNA技术的基本步骤？意义？分—切--接—转—筛。 1、 目的基因和载体的分离纯化：
目的基因的获取：化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR。
载体：质粒、噬菌体、病毒三大类载体均经人工构建，除去致病基因，有筛选标志、单一限制酶切点. 2、 目的基因和载体的切断：通常用限制性核酸内切酶分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组. 3、 重组DNA连接：目的基因与载体连接，构建重组DNA分子： ① 粘性末端连接：同一种限制酶酶切目的基因和载体，产生相同粘性末端，DNA连接酶将两者连接。 ② 平头末端连接：T4 DNA连接酶。两个具有平头末端的双链DNA分子链接。问题：低效率、串珠现
象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；
③ 同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人
工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；
④ 人工接头连接法：合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接。 4、 重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。 受体为细菌时---电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时----电击法、基因枪、显微注射法。 导入的类型：①转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。②转染transfectim：以病毒作载体??。③转导conduction：以噬菌体作载体??
5、 重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：①平板筛选：插入失活筛
选、蓝白斑筛选；②限制酶切图谱筛选；③ PCR筛选；④原位杂交技术。 6、 受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。
意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。 举例说明两种重组DNA转化的方法？
1、 基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的μm或
亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。
2、 电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。 3、 显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但
需要一定设备和操作技巧。 补充：常用工具酶： 限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，ATP，SAM）。能识别由4~6个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的---在基因工程操作中有重要价值。
DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。 DNA pol I：5’-3’聚合活性、5’-3’外切活性（被前者抑制）、3’-5’外切活性。用途：探针标记；补平3’末端。 Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5’-3’聚合活性、3’-5’外切活性。 T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。 DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。 催化连接反应时，需要一条DNA链3’末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5’末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3’-OH与5’-P之间可形成3’-5’磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。 只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。 T4 DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。
逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。 T4多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端。可用于探针标记DNA的5’末端，还可用于使缺失5’-P末端的DNA发生磷酸化作用。
TTE末端转移酶：5’-3’聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3’末端同聚物尾巴。 APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5’-P →5’-OH。
标记探针：5’-P 通过APE变成5’-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5’-P（标记）。 ? 分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？
象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；
③ 同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人
工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；
④ 人工接头连接法：合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接。 4、 重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。 受体为细菌时---电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时----电击法、基因枪、显微注射法。 导入的类型：①转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。②转染transfectim：以病毒作载体??。③转导conduction：以噬菌体作载体??
5、 重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：①平板筛选：插入失活筛
选、蓝白斑筛选；②限制酶切图谱筛选；③ PCR筛选；④原位杂交技术。 6、 受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。
意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。 举例说明两种重组DNA转化的方法？
1、 基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的μm或
亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。
2、 电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。 3、 显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但
需要一定设备和操作技巧。 补充：常用工具酶： 限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，ATP，SAM）。能识别由4~6个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的---在基因工程操作中有重要价值。
DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。 DNA pol I：5’-3’聚合活性、5’-3’外切活性（被前者抑制）、3’-5’外