切活性。用途：探针标记；补平3’末端。 Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5’-3’聚合活性、3’-5’外切活性。 T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。 DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。 催化连接反应时，需要一条DNA链3’末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5’末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3’-OH与5’-P之间可形成3’-5’磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。 只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。 T4 DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。
逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。 T4多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端。可用于探针标记DNA的5’末端，还可用于使缺失5’-P末端的DNA发生磷酸化作用。
TTE末端转移酶：5’-3’聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3’末端同聚物尾巴。 APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5’-P →5’-OH。
标记探针：5’-P 通过APE变成5’-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5’-P（标记）。 ? 分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？
? 如欲在转录水平检测某种基因的表达，应该用哪些方法？举例说明其原理。
选择个别基因在何种特定的组织或细胞、特定的体内外条件或发育阶段进行表达。 主要涉及3种因素的相互作用： RNA聚合酶；顺式调控元件；反式作用因子 顺式调控元件的研究方法：
1、报告基因(reporter gene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 2、转染（transfection）：通过生物学、物理学、化学等方法使外源DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转染。 3、5’ 缺失突变实验：鉴定真核基因DNA上游转录调控序列的调控元件：1个位于2与3之间；另一个位于4与5之间。
反式作用因子的研究方法：转录因子活性谱芯片
生物样品(组织或细胞)；抽提核蛋白，蛋白浓度测定；核蛋白与转录因子结合序列的混合物共同孵育分离回收与核蛋白中转录因子发生结合的探针；扩增并荧光标记；芯片杂交和扫描；数据分析 生物信息学方法： TRANSFAC数据库，这个数据库从发表的文献中收集了转录因子、转录因子结合部位及结合部位序列信息。 Horsman S等设计出一个BLAST搜索工具，称之为TF target mapper。此软件能够快速提取靶点附近基因的注解信息，有助于全面分析调控信息，并有利于弄清楚特异转录因子的作用机制，最终了解这些转录因子在生物体的哪些途径中发挥作用。 ? DNA损伤修复的机制？
（一） 直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。 1. 光修复----针对嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有。
过程：①UV照射下，形成嘧啶二聚体；②光复活酶与T=T结合形成复合物；③酶被可见光所激活（最佳波长400mm），切断T=T之间的共价键，二聚体变为单体； ④修复后释放酶。 2. 链断裂的重接---针对DNA单链断裂。DNA连接酶。普遍存在，容易进行。双链断裂几乎不能修复。 3. 碱基的直接插入---针对AP位点。DNA嘌呤插入酶。 （二） 切除修复 ? 最普遍的修复形式，针对多种DNA损伤：AP位点、嘧啶二聚体、链断裂、碱基烷基化等。 ? 多步骤多酶参与的过程：DNA内切酶、外切酶、连接酶、聚合酶等共同作用下，将受损部位切除，并以另一条链为模板合成修复。 ? 特点：暗修复；复制前修复；修复对象为亲代DNA。 ? 过程：①内切酶识别损伤位点，并在其两侧切开；②外切酶除去两个切口之间的核苷酸； ③聚合酶催化DNA合成；④连接酶连接。 （三） 重组修复 ? 当DNA损伤较大，无法及时修复or缺乏切除修复酶系，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后在重组基因rec编码的酶（rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶作用下，进行重组修复。 ? 特点：复制后修复。模版上伤疤始终留着，只是随重组修复次数↑逐步稀释。修复对象为子代DNA。 ? 过程：①复制：损伤母链复制时，跳过损伤部位，子链对应位点留下缺口，无损母链复制成完整双链。②重组：有缺子链与无损母链发生重组，缺口转移至无损母链，使损伤母链的互补链完整，损伤母链依然保留。③再合成：转移后的母链缺口以新的互补链为模板聚合补齐。 （四） SOS修复 ? DNA受到严重损伤难以继续复制，或DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证DNA链的完整性，应急产生校对功能较低的修复酶，采用填补任意碱基的方式修复。这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称为SOS修复，也称差错倾向修复。广泛存在于原核生物与真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变，自然界也因此而变的物种繁多。 ? 基因突变？其后果（意义）？ 基因突变（gene mutation）：由于DNA分子中发生碱基对的替换、插入、缺失等,从而引起基因结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的时间：DNA复制时期，即细胞分裂间期（有丝分裂和减数分裂） 基因突变若发生在体细胞，则影响其功能和生存。可导致疾病甚至癌变或死亡---不遗传；若发生在生殖细胞，则可能影响后代---可遗传。基因突变的特性：普遍性、随机性、低频性、可逆性、多害少利性。 基因突变的形式：替换、缺失、插入、重排。
(一)点突变/ 替换：指DNA分子上一个碱基对的变异：
1. 转换 (transition)：同型碱基间的置换: 嘌呤代替另一嘌呤，嘧啶代替另一嘧啶。 2. 颠
换 (transversion)：异型碱基间的置换：嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤。
(二)插入(insertion)；缺失(deletion)：
引起三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变----框移突变。 正常 5′? ?GCA GUA CAU GUC ? ? 缺失C 5′? ?GAG UAC AUG UC ? ? 丙 缬 组 缬 谷 酪 蛋 丝 (三)重排(rearrangement) / 重组：
指DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。 移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。 突变的意义：
1、 突变是进化、分化的分子基础：产生新基因的途径；生物变异根本来源；为生物进化提供原始材料。 2、突变导致基因型改变：仅改变基因型而无可察觉的表型改变；本质上来讲，多态性的产生在于基因突变，一般发生在基因序列中非编码区。对个体而言，基因多态性碱基序列终生不变，并世代相传。 3、突变导致死亡：突变若发生在对生命至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。 4、突变是某些疾病的发病基础：包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的疾病。
点突变：镰刀型红细胞贫血。
血红蛋白HB基因发生碱基对置换→红细胞形状改变。 ? 衰老细胞的生物学和形态学特征？
生物学特征：1、细胞阻滞于G1期，无法进入S期；2、不可逆丧失对有丝分裂原的反应能力；3、调控细胞生长的关键基因的表达发生变化，正向转录因子抑制，负向转录因子过量表达；4、细胞功能“脱分化”；5、发生凋亡的能力下降。
形态学特征：1、细胞核增大，核内出现包含物，核膜内陷，染色质凝聚；2、细胞质内色素积累，脂褐质积累，影响细胞正常功能，细胞工作效率降低，出现衰老。3、细胞膜流动性降低，干扰了膜蛋白的正常结构与功能。4、线粒体数目减少，体积增大；5、高尔基体囊泡肿胀，出现扁平囊泡断裂崩解，分泌及运输功能衰退。6、内质网排列无序，膜腔扩大甚至崩解，膜上核糖体数目减少. ? 建立转基因动物模型的基本原理和应用？ ? 凋亡
凋亡：多细胞生物为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动的的有序性的自我消亡，又称细胞程序性死亡PCD。从严格意义上来说，凋亡与PCD有很大区别。PCD：多细胞生物个体发育过程中，预定的并受到严格程序控制的细胞死亡。是一个功能性概念、发育学概念。仅存在于发育细胞。而凋亡是形态学概念，可存在于发育细胞及成体细胞。大部分凋亡是PCD，但某些凋亡明显是非程序性，如细胞毒物诱导的凋亡。 凋亡的形态学特征：
①早期：胞浆脱水浓缩，胞膜空泡化，染色质固缩成新月形，边集于核膜下。 ②晚期：凋
亡小体形成（内含有结构完整的细胞器）； ③最后：凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞所吞噬清除。 凋亡的生化特征：
①染色质DNA片段化：内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180~200bp整倍数的寡聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现特征性的梯状条带—ladder；
②内源性核酸内切酶激活，凋亡中执行DNA切割，作用位点在核酸内部磷酸二酯键； ③凋亡蛋白酶caspase激活：caspase是一类促凋亡的蛋白水解酶，活性中心富含半胱氨酸Cys，对底物的天冬氨酸部位Asp有特异性水解作用。Caspase蛋白酶的级联反应是导致凋亡结构改变的主要环节。 ④钙离子浓度上升：外钙流入，内钙释放，启动凋亡。 ⑤线粒体改变：膜通透性上升，释放Cyto-C启动凋亡。（Cyt-C，AIF均为线粒体释放的促凋亡蛋白） 细胞凋亡的4阶段： ①凋亡信号转导（凋亡诱导因素 + 受体 + cAMP , Ca2+，神经酰胺）；②凋亡相关基因激活； ③细胞凋亡的执行（caspase激活，DNase激活）；④凋亡细胞的清除（巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞） 细胞凋亡的信号转导：多样性、偶联性、同一性、多途性。
① 死亡受体通路：死亡配体（细胞外）→死亡受体（细胞膜）→相关蛋白（中介蛋白，细胞内）→激活caspase8→激活caspase3→细胞凋亡。 死亡受体：膜蛋白，如TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等。
② 线粒体通路：凋亡复合体形成，激活caspase9；凋亡诱导因子AIF释放，激活DNase，促进Cyt-C释放；释放Smac/Diablo，阻断凋亡抑制蛋白IAPs的作用。 ③ 内质网通路：内质网应激→未折叠蛋白堆积，线粒体bcl-2下调，cyt-c释放；Ca2+释放；激活caspase12。 ④ 氧化损伤学说：可激活p53基因；可导致膜损伤，Ca2+内流↑；可激活Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶；可活化核转录因子NF-kB和AP-1，加速细胞凋亡相关基因的表达。 ⑤ 钙稳态失衡学说：可激活Ca2+/Mg2+依赖型核酸内切酶（降解DNA）、谷氨酰胺转移酶（利于凋亡小体形成）、核转录因子；Ca2+在ATP配合下使DNA链舒展，有利于切割DNA。 凋亡相关基因：
① 抑制凋亡：Bcl-2 、 EIB 、 IAP
② 促进凋亡：Fas和FasL系统 、 p53 、 Bax 、 ICE ③ 双向调控：c-myc
Bcl-2：第一个被确认的抑凋亡基因。机制：为抗氧化剂，直接抑制过氧化物诱导的凋亡；抑制线粒体释放促凋亡蛋白（AIF, Cyt-c）；抑制促凋亡因子Bax、Bak的细胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶激活；维持钙稳态。 P53：诱导凋亡。G1期发挥卡点功能。DNA损伤→p53活化↑→G1阻滞，DNA损伤修复。损伤不能修复→细胞凋亡。突变型p53会导致损伤DNA继续复制，引起更多突变积累，细胞癌变。 Fas/FasL系统：主要涉及免疫系统细胞死亡。参与CTL细胞的杀伤机制。
c-myc基因：表达产物myc是DNA结合蛋白。c-myc的表达是一个启动细胞增生和细胞凋亡的共同信号：
c-myc↑、生长因子存在→细胞增殖； c-myc ↑、生长因子不存在→细胞凋亡； c-myc不表
达、生长因子不存在→生长抑制。 凋亡vs坏死？
凋亡 坏死 细胞形态 皱缩 肿胀 细胞膜 始终完整 破裂 细胞器 形态改变较轻 肿胀、破裂 细胞核 染色质凝集、断裂 固缩、核膜破裂 凋亡小体 有 无 DNA 断裂有规律、梯形条带 随机降解 分子机制 多基因参与、有序控制 无基因调控 炎性反应 无 细胞内容物流出，引起周围炎症 补充：
cDNA芯片技术 : RT-PCR产生荧光标记的cDNA →与芯片杂交孵育→扫描分析结果 PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）：根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
2D-PAGE（2 Dimensional-PAGE）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：结合了IEF等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS-PAGE（根据蛋白质的大小进行分离）。
抗体芯片技术：从50~200mg组织或细胞、体液中抽提蛋白质→Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子→分别标记两个样品→洗去多余的标记分子→与芯片杂交孵育→扫描分析结果。 抗体芯片Antibody chip ：微型化、集成化、高通量化 RNAi的作用机制？