Shawkea T-1对治疗不孕、糖尿病及对抗病毒的功效 以及对肾脏与其他疾病的改善抑制作用的研究报告（不孕篇）
人） 未使用患者(3人) 推迟 非常强烈 温期延长0.76天 减少 6
【医师的反映情况】
改善了卵子的质量增加了卵子的数量。
根据神琦妇产科医院、西山妇产科医院、汉方野崎药店等汇总的34名患者中，使用T-1的患者获得的卵子等级高，数量多。 治疗时间 排卵周期 妊娠率（%） 以往的治疗方法 18个月 10个月 50% 配合服用T-1 14个月 8个月 70%
通过对使用以往治疗方法（12人）和配合使用T-1治疗的32人对比发现，后者的治疗时间和排卵周期分比缩短了4个月和2个月，怀孕率却提高了20%。（摘自一般经营性社团宝宝顾问集）。
5.T-1蒲公英提取物增加老鼠生殖激素受体数量
大阪市立大学院医学研究科 妇产科科学讲堂
【摘录】
生殖激素通过各类组织中的受体来发挥其作用。本次论文主要是调查了使用T-1蒲公英提取物（DT-1E)6周后的老鼠，其脂肪组织生殖器官的雌激素受体（ERα及ERβ）、孕酮受体（PR）以及促卵泡生成激素受体（FSHR)的变化。使用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应）分析的结果显示使用含有DT-1E的饲料对老鼠进行喂养后，其脂肪细胞中ERα及ERβmRNA的发现量要高于对照组。另外注射绒毛膜促性腺激素后，使用DT-1E一组在ERα及ERβmRNA还有卵巢FSHRmRNA的等级要高于对照组。对免疫组织进行的化学分析也显示DT-1E组的受体等级明显上升。从本次的实验表明口服DT-1E，老鼠本身的ERα及ERβmRNA还有卵巢FSHRmRNA等级升高，同时揭示了其对生殖激素障碍的临床治疗上有利用的可能性。
关键词：雌激素受体ERα、雌激素受体ERβ、孕酮受体、促卵泡生成激素受体、T-1蒲公英提取物、老鼠
【介绍】
雌激素、孕酮、以及促卵泡生成素等生殖类激素和各种生物化学、生理学的过程有着密不可分的关系，所以其可导致女性中的包括更年期症状、肥胖、各种癌变等各种病症。通常是通过调整激素值来治疗因激素值引起的各类病症。比如说使用激素补充疗法（HRT)虽然可以减轻更年期症状，但是同时也有对其产生依赖的风险。另外因为激素都是通过受体发挥其作用的，所以大可以通过查明受体来了解有激素引起的各类病症。本方法可以替代激素补充治疗法，对开发更加方便，副作用风险更小的治疗法有所帮助。
今年来因为汉方药逐渐开始普及、疗效理想的同时副作用小，所以广被使用。虽然现在对其的作用机序还不是很明了，但是汉方药广泛使用在由女性的生殖激素导致的各类病变上。所以我们假设汉方药关乎于生殖激素的量以及对受体等级的影响。
基于以上观点，本次的实验使用含有DT-1E的饲料对雌鼠进行6周的喂养后，对其血清中激素的浓度变
Shawkea T-1对治疗不孕、糖尿病及对抗病毒的功效 以及对肾脏与其他疾病的改善抑制作用的研究报告（不孕篇）
化、脂肪组织、子宫、以及卵巢的雌激素受体（ERα及ERβ）、孕酮受体（PR）以及促卵泡生成激素受体（FSHR）的等级以及对排卵的影响做了调查了。
材料及方法 动物和饲料
本实验的环境以及使用的动物均按照大阪市立大学动物实验基准进行、且得到校内动物实验委员会认可的。试验用36只4周龄的雌鼠为从横滨的专业机构购买，将其任意分为4组（每组9只）后放入容器，保持固定的温度（23±1）和湿度（55%）,昼夜12小时/12小时 进行单独喂养。6周的饲养时间段内，雌鼠可以自由摄取饲料和水。对其中的2组对照组投用不含有植物性雌激素的普通饲料，，对剩余2组投用DT-1E含量为0.03%的饲料。DT-1E的成分为87%的蒲公英提取物，5%的薏米、5%的蔗糖、3%的黑蚂蚁。对对照组和DT-1E组的其中各一组的雌鼠，在达到10周龄时注射绒毛膜促性腺激素。先将稀释在0.1毫升杀菌用生理盐水的孕马血清注入到各雌鼠体内5IU，46小时后再将用0.1毫升杀菌用生理盐水稀释的绒毛膜促性腺激素5IU，注入到雌鼠体内。注射后12小时，将包括另外两组在内的4组实施安乐死。之后进行解刨，取出子宫旁脂肪组织、子宫以及卵巢。
测定血清中的激素浓度
在解刨雌鼠的过程中，对腹部大动脉进行血样采集，使用从美国加州专门的医疗机构购买的器械采用放射免疫测定法对血清中的雌激素浓度进行了检测。检出值的上限为1.4pg/ml、检测期间的变动值分别为1.75%和2.58%。
提取核糖核酸、反转录、实时荧光定量PCR
使用另一种购自美国加州的设备根据其说明书提取出脂肪细胞、子宫以及卵巢内的核糖核酸（RNA)。之后在-80℃的环境下保存至下一步处理工序。第二阶段进行实时荧光定量聚合酶链式反应，测定出mRNB值。使用TaqMan反转录实验药品在cDNA上对保存的核糖核酸（RNA)进行反转录。基于TaqMam Gold RT-PCR的规定，将调制的反转录酶反应混合液1ul加入到核糖核酸（RNA)样品中，最终容量达到100ul.反转录的反应温度和时间分别是25℃，10分钟、37℃，60分钟、95℃，10分钟。
TaqMan 量化实时PCR 是用ABISM7700持续探测系统（均按照生产商的操作说明）在50-μl 混合物中进行，使用适当的3'- 6 - 羧基标记的小沟粘结剂的引物和探针为cDNA 对ER α (Mm00433153_m1),ER?Mm00599821_m1), PR (Mm00435628_m1), and FSHR (Mm00442819_m1) (Applied Biosystems)编码.虽然寡居核苷酸不是公认的最合适的，但是他们是被生产商确认有效的。
mRNA转录产物数量值是按照相对CT (ΔΔCT)法进行操作的。符合内源参数标准-18S rRNA (美国应用生物系统公司)及于校准器有关的目标值是通过估算2-ΔΔCT(11-13)得出的，其相关公式是ΔΔCT = ΔCT,s -ΔCT,cb。CT是一种ABI PRISM 7700 持续探测软件给出的作为参数的数值，其与反应系统中的内在的mRNA原始数值有负关联。ΔCT 是指目标值和参数值之间的循环阈值的不同。ΔCT,s 是样品的ΔCT 值。ΔCT,cb是校准器的ΔCT 值（控制组的中线）。脂肪组织中和生殖器官的免疫组织化学。为了ERα, ER?PR 和FSHR的免疫组织化学研究，我们去掉了小鼠脂肪组织，子宫和卵巢中的石蜡包埋部分(4-μm厚) 的石蜡包埋切片脂肪组织。抗原修复程序侵泡在柠檬酸缓冲液（pH 6.0 ）中进行，并持续15分钟在110? 高压消毒锅中高温加热。经过磷酸盐生理缓冲液中（PBS)清洗后，组织部分和5%山羊血清一起在含有0.05% Tween-20 的容器中封锁十分钟。我们把每个载玻片和抗小鼠ERα，抗小鼠ER?，抗小鼠PR 或者抗小鼠FSHR，兔血清在夜晚4?温度的环境里进行培养。经过在含有0.05% Tween-20 的PBS 中清洗后， 为了得到ER α and ER?值， 组织部分和rhodamine-conjugatedanti-rabbit IgG donkey antibody (Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)在室温环境下培养1个小时，同时为了PR and FSHR，组织部分和fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugatedanti-rabbit IgG goat antibody (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA)也在相同环境下培养。然后再次在含有10% PBS的甘油溶液中清洗，这样通过荧光显微镜就能发现免疫
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Shawkea T-1对治疗不孕、糖尿病及对抗病毒的功效 以及对肾脏与其他疾病的改善抑制作用的研究报告（不孕篇）
荧光图像。体积计算。注射hCG 12小时后从小鼠切除的输卵管中收集卵子。卵子数量通过使用立体显微镜(SZX-ZB12;Olympus Corporation)来计算。统计：各组之间区别使用5.0版本StatView并通过非参数统计分析来进行比较。P<0.05 被认为是统计学的象征。数据分析的结果通过box-plots 图表展现出来,50%的数据被总结在这个图表上。每个图表上的线代表了中值，图表外的线代表了90%信赖区间。 【结果】
血清雌激素浓度。
经过检查小鼠血清中雌激素浓度，注射或者不注射促性腺激素，DT-1E组和另外两组之间没有发现明显区别。对于那些没有注射促性腺激素的小鼠来说，在控制组的小鼠的雌二酮浓度是9.3±1.8pg/ml，食用DT-1E小组中小鼠的雌激素浓度是10.8±2.5 pg/ml。经过注射促性腺激素后，控制组的小鼠雌二酮浓度是12.3±6.5 pg/ml，DT-1E组的小鼠雌二酮浓度是12.4±4.4 pg/ml。 脂肪组织和子宫中的ERα 和ER?RNA量化分析。
我们对投用普通食物没有注射促性腺激素的雌鼠子宫和脂肪组织使用TaqMan real-time RT-PCR 检测ERα和ER?RNA 值。从TaqMan 商业试剂的功效成一贯性上可以表明小鼠脂肪组织和子宫中ERamRNA值比ERa高许多。
脂肪组织中ERa和ER?的表现情况。
通过量化实时RT-PCR ( P<0.05) (图. 2)，对于没有注射促性腺激素的小鼠脂肪组织中的ERα 和ER?RNA检测后发现， DT-1E组明显高于对照组(无DT-1E).DT-1E组的ERs的免疫荧光比对照组(图. 5A和C)更明显。 子宫中的ERα, ER?和PR的表现情况。
对于没有注射促性腺激素的两组，ERα, ER?or PR mRNA 值没有很明显的区别。然而，经过注射促性腺激素后，DT-1E组的子宫ERα, ER?和PR mRNA表达值明显高于控制组（不食用DT-1E)(P<0.05) (图. 3)。而且对ERα, ER?和PR mRNA抗体注射促性腺激素的雌鼠的子宫上皮组织子宫间质细胞免疫组织实验可以看出DT-1E组（图6B、D和F）要明显强于对照组（图6A、C和E).
各组小鼠卵巢FSHR的表现情况比较。
在没有注射促性腺激素的的雌鼠中，DT-1E组和对照组的雌鼠卵巢中FSHR、mRNA表现值没有明显区别。然而，经过注射促性腺激素后，DT-1E组的卵巢FSHR、mRNA表现值明显高于对照组（不食用DT-1E)(P<0.01) (图. 4)。注射促性腺激素的雌鼠卵巢颗粒细胞FSHR的免疫荧光，与对照组(图.7A)相比，DT-1E组(图. 7B)更明显。 注射促性腺激素后雌鼠体内的卵子数量。
进行注射促性腺激素后，我们在解剖过程中，取出了雌鼠的输卵管，并计算了卵子数量。数据表明DT-1E组(中间值7)比对照组(中间值5) (P<0.05)存在有更多的卵子。
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图一
投用普通饲料的雌鼠（未注射促性腺激素），的脂肪组织及子宫中的ERa和ERbmRNA的表现情况。实线代表阈值。X-轴线代表循环阈值。循环阈值是指，CT就是当PCR产品达到阈值的时候，循环增幅的值。ERa表现为小的循环阈值，和ERb 相比，无论是脂肪组织（A）中还是子宫（B)中，ERa 显示出更多的mRNA。右边方框中表现了与ΔΔCT 中等的ERa 和ERbmRNA 数值。
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图二
未注射促性腺激素的DT-1E组和对照组雌鼠脂肪组织中的ERα和ER?RNA的表现情况。TaqManreal-time RT-PCR 量化分析表明经过6周的正常喂食后，DT-1E组中脂肪组织的ERα (A) 和ER?B) mRNA明显高于对照组(P<0.05）。如上图所示。
图三