人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定
年四季 黄 黎 王 栩 邬于川 袁 青(四川省泸州医学院基础医学院,泸州 646000) 中国图书分类号 R392. 11 文献标识码A 文章编号 1000 484X( 2010) 06 0544 04
[摘 要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法: 从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴
细胞中提取总 RNA, 反转录合成 cDNA, 用直接 PCR 及半巢式 PCR 扩增人抗体重链( VH)及轻链( V 和V ) 可变区基因。采用改
进的重叠延伸 PCR 法将 VH 基因和 VL( V 和 V) 基因连接成人单链抗体( scFv) 基因, 并将 scFv 文库基因克隆到噬菌体载体
pCANTAB5E中, 电转化 E . coli TG1, 构建单链抗体文库。结果: 采用直接 PCR 和半巢式 PCR 扩增得到 42 条 VH 基因片段, 16 条V 基因片段, 18条 V基因片段。混合的VH 和VL 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750 bp 左右; 转化后构 建了文库容量为 1. 35 108
的单链抗体文库。BstN !酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的 scFv 指纹图谱均
不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。 [关键词] 单链抗体;噬菌体抗体文库; 重叠延伸 PCR
Construction and identification of nonimmunized human phage display library
NIAN Si Ji , HU ANG Li , WANG Xu , WU Y uChuan, YU AN Qing. School o f BasicMedical Sciences, Luzhou Medical Col
lege, Luzhou 646000, China
[Abstract] Objective:To develop non immunized human phage display library.Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe
ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain ( VH) and light variable chain
( V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of VH and VL( V and V) were
linked. The linked genes of single chain Fv fragment ( scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1 for the scFv
library construction. Results:By direct PCR and half nested PCR, 42 VH fragments, 16 V and 18 Vfragmen ts were obtained. The size of linked
scFv library genes was 750 bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10 8
. The results of BstN ! analysis of scFv genes from
the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can be used for selecting humanized scFv.
[Key words] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR 目前单克隆抗体( mAb) 作为治疗性抗体发展
迅速,主要用于免疫治疗肿瘤、 免疫性疾病、 器官移 植、 感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的 临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产 生的人抗鼠抗体( HAHA) 反应、 肿瘤渗入量低及半
衰期短的问题[ 1]
。随着基因工程技术的发展, 各种
形式的基因工程抗体被构建来改善它们的性能和效 能,其中小分子单链抗体( single chain Fv fragment, scFv)可通过噬菌体展示的方法制备, 从而使完全人 源化的抗体制备成为可能, 并且单链抗体分子量小, 组织穿透力强[ 2] 。
噬菌体抗体文库技术的出现是抗体工程领域的 重大技术突破。文库容量和多样性是衡量抗体文库 质量的两个重要参数。文库容量越大, 从中筛选得 到抗体的可能性越大, 而且文库容量的大小与所获 抗体的亲和力成正比。在抗体文库的构建过程中, 另外一个重要的指标为抗体文库的多样性,文库的 多样性可通过设计能扩增所有抗体基因的 PCR 引 物加以实现。本研究以未经免疫的健康人外周血为 基因来源,以一套被证明能扩增出所有抗体基因的 PCR 引物及自行设计的引物扩增获得全套抗体可变 区基因,从而构建文库容量大、 多样性相对良好的人 源性天然噬菌体抗体库,为以后筛选针对各类病毒、 毒素、 肿瘤特异性抗原及自身免疫疾病相关抗原的 特异性人源治疗性单克隆抗体奠定基础。
? 544 ? 中国免疫学杂志 2010年第 26卷1 材料与方法 1. 1 实验试剂 大肠杆菌 TG1、辅助噬菌体
M13K07及pCANTAB 5E 噬菌体载体均购自Gene 公 司。淋巴细胞分离液为天根生物技术有限公司产 品。MMLV 反转录酶和 RNase inhibi tor 等反转录试 剂及PCR 试剂购自Promega公司。
1. 2 引物设计 人抗体可变区引物序列是根据文献 [35]中的人抗体可变区引物序列重新设计而成(表 1) ,重新设计的引物有利于简化抗体基因组装程序, 提高组装效率,并且可增加抗体文库的多样性。 1. 3 实验方法
1. 3. 1 人淋巴细胞cDNA 的合成 抽取60 例未经 主动免疫健康人的外周血, 用淋巴细胞分离液常规 分离淋巴细胞, 按 Trizol 说明书提取淋巴细胞总 RNA,以oligo dT 为引物反转录合成第1 链cDNA。 1. 3. 2 VH 和VL 基因的扩增 直接PCR 扩增VH 和 VL 基因:以第1 链 cDNA 为模板, 将VH 基因的上游 引物和VH 基因的下游端引物两两配对, 共组成42 对引物;将V和V基因的上游引物和下游引物两 两配对,分别组成16 对引物和18 对引物, PCR 扩增 VH、 V和V。PCR 反应条件为94 # 1 分钟, 55 # 1 分钟, 72 # 1 分钟,共30个循环, PCR 产物经琼脂糖
凝胶电泳鉴定后回收纯化。半巢式PCR 扩增VH、 V 和V基因: 以第一链cDNA 为模板, 将扩增 CH 基因 的下游引物 ( CH1R、 CH2R 和CH3R) 等摩尔比混合, 作为1条下游引物使用,与VH 基因上游引物配对扩 增,将扩增得到的PCR 产物纯化并混合作为模板, 再以VH 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成 42 对引物扩增得到VH 基因片段; 同样, 用V 上游 引物与半巢式 PCR 下游引物 CR 扩增 cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板, 以V的上游引物与下 游引物两两配对, 共组成 16 对引物进行扩增得到 V基因片段。用V上游引物与半巢式PCR 下游引 物CR 扩增 cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模 板,以V的上游引物与下游引物两两配对, 共组成 18 对引物进行扩增得到V基因片段。第1 轮半巢 式PCR条件为: 94 # 1 分钟, 50 # 1 分钟, 72 # 1 分 钟,共30 个循环。第2 轮PCR 的条件为: 94 # 1 分 钟, 55 # 1分钟, 72 # 1 分钟,共30 个循环。PCR 产 物经琼脂糖凝胶鉴定后回收纯化。
1. 3. 3 scFv 基因的拼接 将所有回收的VH 基因片 段混合即得到VH 基因文库;同样将回收的V基因 片段混合得到V 基因文库;将回收的V基因片段 混合得到V基因文库,将VH 基因库以VHscFvF 为 上游引物,以linkerR为下游引物,进行PCR 扩增,获 得VHlinker 基因片段; 将V 基因文库以上游引物 linkerF 和下游引物VscFvR 为引物, 进行PCR 扩增, 获得linkerV基因片段;将V基因文库以linkerF和 V sc FvR 为引物, 分别进行PCR 扩增, 获得linkerV 基因片段。PCR 反应条件为 94 # 1 分钟, 55 # 1 分 钟, 72 # 1分钟, 共30 个循环。PCR 产物均经琼脂糖 凝胶电泳,切胶回收目的片段。
表 1 构建天然人源 scFv文库的引物
Tab. 1 Oligonucleot ide primers for construction of non immu nized human scFv library VH f orward primers:
5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA 3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG 3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY 3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAGCTKGTRCAGTCTGG 3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG 3 ? 5 ?ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG3 ? VH reverse primers:
5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG 3 ? 5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT 3 ?
5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAAGAGACGGTGACCATTGT 3 ? 5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC3? 5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCGGTTGGGGCGGATGCACTCC3 ? 5 ? TCCGCCGAGACCGCCTCCACCSGATGGGCCCTTGGTGGARGC3 ? Vforward primers:
5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGACATCCRGDTGACCCAGTC TCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAAA TTGTRW TGACRCAGTCTCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAT A TTGTGMTGACBCAGWC TCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGAAACGACAC TCACGCAGTCTC 3 ? Vbackward primers:
5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC3? 5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCASCTTGGTCC3 ? 5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCC 3? 5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC3 ? Vforward primers:
5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCT ATGWGCTGACWCAGCCAC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCT ATGAGCTGAYRCAGCYACC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGCCTGTGCTGACTCARYC 3 ?
5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGCCWGKGCTGAC TC AGCC MCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGTCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGCAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT 3 ? 5 ?GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGAATT TT ATGC TGACTCAGCCCC 3 ? Vbackward primers:
5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTSASCTTGGTCC3 ? 5 ?GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC3 ? CH1R: 5 ? GGATCCTCTAGATTTACCCGGAGACAGG 3 ? CH2R: 5 ? TCTATCCACGAGGGTCC3? CH3R: 5 ? CTCTCTTGTCCACCTTGT3?
CR: 5 ? GGATCCTCTAGAACACTCTCCCCTGTTG 3 ? CR: 5 ? CATTCATGAGACACACCT 3 ?
VHsc FvF: 5 ?ATCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGT 3 ? V sFvR:ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTT3 ? V sFvR:ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACC 3 ?.
L inke rF: 5 ?TC AGGTG GAGGCGGT TC TGGC GGAGGT GGC TC AGGCGG TGGAGGC TCG3 ? Li nkerR:5 ? CGAGCC TCCACC GCC TGAGCCACC TCC GC CAGAACC GC CTC CACC TGA5 ?
? 545 ? 年四季等 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 第6 期 混合linkerV和linker V得到linker VL 基因片
段。将等摩尔的 VHl inker 基因片段与 linker VL 基 因片段混合后, 进行PCR 连接。反应条件为: 94 # 1 分钟, 65 # 1 分钟,共25个循环。然后取前一轮PCR 产物1 l 再进行第二次PCR 扩增,凝胶回收PCR 产 物,得到连接好的sc Fv基因片段VHlinker VL。
1. 3. 4 噬菌体抗体文库的构建 用Sfi !、 Not !酶 切scFv 基因片段, 与经同样双酶切的 pCANTAB5E 载体在T4 连接酶作用下进行连接(连接反应体积共 20 l )。取连接产物 1 l 电转100 l 感受态细胞 TG1, 转化产物立即加入 37 # 预热的 3 ml 2 YTG (含2% 葡萄糖)培养基中, 180 r/ min 振荡1小时后, 转化产物稀释10倍后取 1 l涂于2 YTAG(含 2% 葡萄糖, 100 g/ ml 氨苄青霉素)平板上, 37 # 培养过 夜。次日,计数菌落数, 并挑取10 个菌落, 进行菌落 PCR 检测,计算插入有全长scFv 基因的菌落比例,从 而得到噬菌体文库的容量。如果文库容量达到 108 ,
则将剩余连接产物经乙醇沉淀纯化后用6 l TE 溶 解,每次取1 l 纯化后的连接产物电转化感受态 E. coli TG1,重复6次。转化产物180 r/ min 振荡培养1 小时,将转化产物涂于2 YT AG 大平板上, 37 # 培养 过夜。次日,收集所有平板中的菌落并加入终浓度为 15%的甘油,分装后液氮速冻保存于- 80 # 。
1. 3. 5 噬菌体抗体文库多样性分析 从scFv 抗体 文库中随机挑取单菌落, PCR 鉴定是否插入有全长 scFv基因,随机取10 个阳性PCR 产物并纯化后, 用 BstN !进行酶切, 3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切指 纹图谱。 2 结果
2. 1 总RNA 的提取 用淋巴细胞分离液分离外周 血淋巴细胞, 镜检并计数后按10 8
细胞/ ml Trizol 的
比例, 提取人外周血淋巴细胞总RNA。经1% 琼脂 糖凝胶电泳后清晰可见28、 18和5 S 3 条带,说明提 取的总RNA 质量较好。
2. 2 人VH 和VL 基因的扩增 本研究采用了60 个 不同健康志愿者的外周血淋巴细胞,其包含了足够 多样性的人抗体基因, 并且选用的抗体基因引物也 几乎覆盖了人抗体基因的各个家族, 在直接PCR 扩 增VH 和VL 基因的基础上,同时采用了半巢式PCR, 以保证所有的抗体基因都能得到扩增。直接 PCR 的结果显示, 只有部分VH 和VL 基因能被扩增出 来。以半巢式PCR 加以辅助, 最终有效扩增到所有 的VH、 V及V基因(图1) 。
2. 3 sc Fv基因的组装与扩增 传统scFv 基因的拼 接采用3 个片段重叠延伸PCR( SOE PCR) ,该方法需 要合成大量不同的引物, 而且操作繁琐,费事费力, 连接效率低。本研究采用 2 个片段SOEPCR 法将