VH 和VL 基因组装成 scFv 基因, VH 和 VL 之间以 linker (Gly4Ser) 3 基因序列连接。SOEPCR 组装法操 作简单,节省时间,并且组装成功率高, 同时也能使 体VH 和VL 基因组装后产生的scFv 基因多样性最 大化。用PCR 法分别在VH 基因的 3 ?端和VL 基因 的5 ?端加上 linker 序列, 形成VHlinker 基因片段和 VLlinker 基因片段。再将两个基因文库抗等摩尔比 混合,互为引物及模板, 在新的PCR 系统中进行重 叠延伸,即得到完整的scFv 基因片段。然后以完整 的scFv 片段为模板, 进行 PCR 大量扩增, 最终得到 scFv 基因文库,其基因大小为750 bp 左右(图2、 3)。 2. 4 噬菌体展示抗体文库的构建 scFv 基因片段 经s fi !和 Not !双酶切后, 与经同样双酶切的
pCANTAB5E 载体连接。将连接产物取 1 l 电转感 受态TG1, 取复苏的电转化菌液稀释10 倍后取1 l 涂板, 结果平板上长出250 个菌落, 取10 个菌落进 行菌落PCR 鉴定显示,有 9 个菌落插入有全长 sc Fv 基因( 图4) , 即构建的单链抗体文库的重组率为 图 1 PCR 扩增 VH, V及 V
Fig. 1Amplificat ion of VH, V及 V by PCR
Note: DNA marker VII: 300, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 bp. 图 2 凝胶回收扩增的 VH linker, linker V 和 linker V Fig. 2 The recovered DNA of VH linker, linker V and linker Vby gel extract ion kit
Note: M. 100 bp DNA marker; Lane 1.VHlinker; Lane 2. l i nker V;Lane 3. l i nker V.
? 546 ? 中国免疫学杂志 2010年第 26卷图 3 重叠延伸法( SOE PCR) 组装和扩增的 scFv Fig. 3 The assembled scFv by splice overlap extension PCR Not e:M. 100 bp DNA marker;Lane 1 3. scFv. 图 4PCR鉴定单链抗体文库的重组率
Fig. 4 Ident if icat ion of the rate of recombinant clones from scFv library
Not e:M. 100 bp DNA marker;Lane 1 10. Clones 1 10. 图 5 BstN I 酶切后单链抗体指纹图谱
Fig. 5 The fingerprint map of scFv digested by BstNI
Not e:M. 100 bp DNA marker;Lane 1 10. sc Fv 1 10 from scFv library. 90% ,经计算插入有全长scFv 基因的单链抗体文库 容量达到1. 35 108
。将剩余菌液经乙醇沉淀纯化
去盐后,分6 次电转化TG1,涂板并将所有菌落回收 后,加15%甘油分装保存于- 80 # 。
2. 5 噬菌体展示抗体文库多样性分析 从抗体文 库中随机选取10个sc Fv基因, BstN !酶切, 3%琼脂 糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱,结果显示10 个单链
抗体基因的酶切图谱均不同, 说明抗体文库中抗体 分子的多样性良好( 图5) , 可用于针对多种抗原的 抗体筛选。 3 讨论
目前人源性抗体文库基因主要来源于两种途 径:一种是用 PCR 法直接扩增多样性的人抗体基 因,构建天然抗体文库;一种是人工合成或部分人工 合成抗体可变区基因构建全合成或半合成抗体文 库。人工合成的抗体文库可通过人工随机设计抗体 可变区中的关键区域从而增加抗体文库的多样性。 但人工合成的抗体基因, 由于其中有的序列是随机 化学合成的, 可导致抗体文库中相当部分克隆不具 备抗体的生物学活性, 从而产生无效克隆而在文库 容量和多样性方面影响抗体文库的质量[ 6] 。天然抗
体文库的优点在于抗体基因都经过了体内的VDJ 重排和克隆选择, 所生成的抗体100%具有活性,并 且抗体基因来源于人, 制备的抗体免疫原性弱。 抗体文库不仅需要足够的文库容量, 也要具有 良好的多样性。对于天然抗体文库, 抗体基因的来 源直接影响到抗体文库的多样性[ 7] 。为了保证抗体
文库的多样性,本研究采用了60 名健康志愿者的外 周血淋巴细胞,以使扩增到的人抗体基因能够保证 具有广泛的代表性。另外在引物设计方面,能扩增 到所有基因家族的引物是文库多样性的另一保证。 本研究综合考虑了前人设计的人抗体基因引物序 列,并在抗体基因扩增时, 同时采用直接 PCR 和半 巢式PCR, 以保证所有的抗体基因序列都能得到有 效的扩增,从而确保文库的多样性。
另外,在抗体文库构建时, 大部分学者将载体
scFv 文库基因电转化入TG1 后, 直接将电转化后的 菌液保存于- 80 # 或经M13K07 辅助噬菌体超感染 后,以噬菌体形式保存。但重组噬菌体不稳定, 长时 间保存容易造成重组基因的丢失。本研究将电转化 后复苏的所有菌液涂板, 过夜生长后回收平板上所 有的菌落,加入15%甘油分装后保存于- 80 # 。此 种方法保存文库稳定, 进行文库亲和筛选时,只需要 拿出部分分装的菌液用于M13K07 辅助噬菌体超感 然即可。 4 参考文献
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