（ⅱ）己糖激酶实验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、脱氢酶原液和Tris –Mg 缓冲液，10ml可满足最初的和重复三次分析量。
（ⅲ）己糖激酶稀释液：取1ml己糖激酶原液用0.2%Tris –ALB液稀释至100ml。 （ⅳ）分析：将己糖激酶实验试剂、5ml己糖激酶稀释液和含有5ml 0.2%Tris –ALB液的密闭的试管放在25℃±0.2℃的水浴箱中大约10分钟使液体达到预定温度。
空白 测定
Tris-ALB（ml） 1.0 —— HK稀释液 （ml） —— 1.0 HK实验试剂（ml） 5.0 5.0
混匀，立即转移到已含有温度控制在25℃±0.2℃样本的分光光度计的2个检测反应杯中，在340nm连续测定5分钟内空白和试验管的吸光度，对5分钟内任意1分钟吸光度变化应基本一致，在0.005A/分以内，对这个分析而言NAD+的下降表示分析偏差。
（ⅴ）己糖激酶原液催化活性的计算。
HK原液活性量={（dA/dt）╱(E×b）}×Vr/Vs
= dA/dt×(1╱6.23×103 l.cm/mol.cm)× Vr/Vs
= dA/dt×(0.0001605mol/l)×(106μmol/mol)×(1/ 103ml )
×(6/Vs)
={Atest(3分)-Atest(2分) } × （ 0.963μmol/mol）×(1/Vs) =μmol/min.ml =U/ml(25℃HK 原液)
dA=吸光度变化率（本次分析用3分钟和2分钟读数的变化） dt=测定时间变化
E=摩尔吸光度（本次分析条件下，值为6.23×103 l/mol.cm） b=光径（用厘米表示）
Vr=用毫升表示的总的反应体积（上面给出的程序，体积为6ml：5ml HK试验试剂+1ml稀释HK）
Vs=用ml表示的总反应量中的酶原液量（上面给出的程序：1ml被稀释HK加到反应混合液中（包含0.01ml酶原液），因此Vs是0.01ml。 （ⅵ）例如：配制一个HK原液：用厂家报告的含有1395U/ml的商业的悬浮于硫酸铵溶液的HK1ml，用Darrow和Colowick的方法在30℃测定，用Tris –Mg buffer稀释至250ml。HK分析中使用1mlHK原液，3分钟时吸光度是0.203，在2分钟时，吸光度是0.166
HK U╱原液的ml数=（0.203-0.166）/min×0.963μmol/ml×1/0.01 =3.56U/ml(在25℃) （c）6-磷酸葡萄糖脱氢酶分析
（ⅰ）将（a）中ⅰ-ⅵ试剂和0.1MTris –Mg buffer放在25℃±0.2℃的水浴箱中，放20分钟，使液体达到预定温度（原液放冰箱保存，除非需移液时）。 （ⅱ）6-磷酸葡萄糖脱氢酶试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的NAD+原液，ATP原液、葡萄糖、HK原液和Tris –Mg 缓冲液，10ml可满足最初的和重复三次分析量。
（ⅲ）6-磷酸葡萄糖脱氢酶稀释液：取1ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液用0.2%Tris –ALB液稀释至100ml。
（ⅳ）分析：将6-磷酸葡萄糖脱氢酶实验试剂、5ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶稀释液和含有5ml 0.2%Tris –ALB液的密闭的试管放在25℃±0.2℃的水浴箱中大约10分钟使液体达到预定温度。
空白 测定
Tris-ALB（ml） 1.0 —— G6PDH稀释液 （ml） —— 1.0 G6PDH实验试剂（ml） 5.0 5.0
混匀，立即转移到已含有温度控制在25℃±0.2℃样本的分光光度计的2个检测反应杯中，在340nm连续测定5分钟内空白和试验管的吸光度，对5分钟内任意1分钟吸光度变化应基本一致，在0.005A/分以内，对这个分析而言NAD+的下降表示分析偏差。
（ⅴ）6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液活性的计算
6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液活性={Atest(3分)-Atest(2分) } × （ 0.963μmol/mol）×(1/Vs)
= U/ml(25℃6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液)
Vs=在总反应量中，酶原液的量（用ml表示）（上面给出的程序中，被加到反应混合液中的1ml稀释的6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含0.01ml酶原液，因此Vs=0.01ml）。
其他因素的解释见（b）(v)。 （d） NAD+分析
（ⅰ）将（a）中足量的ⅱ-ⅵ试剂和0.1MTris –Mg buffer放在25℃±1℃的水浴箱中，放20分钟，使液体达到预定温度（原液放冰箱保存，除非需移液时）。 （ⅱ）NAD+试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的ATP原液、葡萄糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液和Tris –Mg缓冲液， 10ml足够。 （ⅲ）稀释NAD+：取5ml NAD+原液，用Tris –Mg缓冲液稀释到100ml。 （ⅳ）分析：将NAD+实验试剂、5ml稀释NAD+和含有5ml Tris –Mg缓冲液的密闭的试管放在25℃±1℃的水浴箱中大约10分钟使液体 达到预定温度。
空白 测定
Tris-Mg缓冲液（ml） 1.0 —— NAD+稀释液 （ml） —— 1.0 NAD+实验试剂（ml） 5.0 5.0
混匀，立即转移到已含有温度控制在25℃±1℃样本的分光光度计的2个检测反应杯中，加入NAD+实验试剂10分钟后，在340nm测定空白和试验管的吸光度。反应在10分钟内达到平衡。 （ⅴ）NAD+原液中NAD+浓度的计算： C=A/（E×b）×Vr/Vs
=Atest(10分)╱(6.23×103 l.cm/mol.cm)×(6ml/0.05ml) = Atest(10分)×0.01926mmol╱ml = mmol╱ml(NAD+原液) C=浓度（mmol/ml） A=吸光度
E=摩尔吸光系数（对于本试验：值是6.23×103 l/mol.cm） b=用cm表示的光径 Vr=用ml表示的总反应体积
Vs=在总反应体积中NAD+原液体积（用ml表示）
（ⅵ）本试验中NAD原液浓度至少应在0.005mmol/ml之上，否则该来源NAD不能用于测定葡萄糖。 （e） ATP分析：
（ⅰ）将（a）中足量的ⅱ-ⅵ试剂和0.1MTris –Mg buffer放在25℃±1℃的水浴箱中，放20分钟，使液体达到预定温度（原液放冰箱保存，除非需移液时）。 （ⅱ）ATP试验试剂：在一个带玻璃塞的锥形瓶中，混合等量的NAD原液、葡萄糖、HK原液、6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液和Tris –Mg缓冲液， 10ml足够。 （ⅲ）稀释ATP：取5mlATP原液，用Tris –Mg缓冲液稀释到100ml。 （ⅳ）分析：将ATP实验试剂、5ml稀释ATP和含有5ml Tris –Mg缓冲液的密闭的试管放在25℃±1℃的水浴箱中大约10分钟使液体 达到预定温度。
空白 测定
Tris-Mg缓冲液（ml） 1.0 —— ATP稀释液 （ml） —— 1.0 ATP实验试剂（ml） 5.0 5.0
混匀，立即转移到已含有温度控制在25℃±1℃样本的分光光度计的2个检测反
+
+
+
应杯中，加入ATP实验试剂10分钟后，在340nm测定空白和试验管的吸光度。反应在10分钟内达到平衡。 （ⅴ）ATP原液中ATP浓度的计算 C= Atest(10分)×0.01926mmol╱ml = mmol╱ml(ATP原液)
各因素来源解释见（d）(v)
（ⅵ） 如果ATP原液浓度<0.005mmol/l，则该ATP来源不适用于葡萄糖测定。 （2） 酶试剂准备
（a） 如果ATP 、NAD+、HK和6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液按上述方法检测合格，
酶试剂按下列方法配制： （ⅰ）在1L容量瓶中加200mlATP原液。 （ⅱ）加200ml NAD+原液
（ⅲ）加入相当于总活性800U的6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液，例如：6-磷酸葡萄糖脱氢酶原液4U/ml，则需在这个容量瓶中加入200ml，如果原液<2.7 U/ml，则应加入300ml。对于配制200ml的酶原始储存溶液而言，加入纯酶量相当于起始试剂量的4/5体积合适，这个新要求的原液量是计算起始量的一半。 （ⅳ）加入相等于总活性800U 的HK原液到1L容量瓶中，例如：原液活性4U/ml，则需在这个容量瓶中加入200ml，如果酶原液含量<2.7U/ml，则应加入酶量>300ml，应配制更高浓度的酶原液。对于200ml的起始的酶溶液而言，加入纯酶量相当于起始试剂的4/5体积合适。
（ⅴ）用 Tris –Mg缓冲液稀释到1L，轻轻颠倒混匀，不要用力振荡。 （ⅵ）酶试剂配好后，立即取100ml（100ml相当19个实验）放入清洁、干燥、带螺旋帽的125ml深棕色的硼硅酸盐玻璃瓶中，使用前保存于-20℃。配制和保存的酶试剂在这种条件下可稳定大约6个月，分析当天，从冰箱取出酶试剂放25℃水浴大约1小时或平衡至25℃±1℃。 d 酶试剂验证试验
（1）酶试剂稳定性：取100mg/dl(5mmol/L的葡萄糖标准6ml，稀释成相当于600mg/dl(33mmol/L）标准的上清液，与15ml试剂水混合，用1ml这个稀释液混合5ml酶试剂，立即转移到分光光度计的比色杯中，第二个比色杯不放试剂水（以试剂水为空白），在340nm纪录30分钟溶液吸光度变化。如果酶试剂与葡萄糖稀释液混合后的溶液在6分钟吸光度读数在1.6-1.8A，在8和30分钟时吸光度值≤0.010A，表明酶试剂质量没有问题。