苏州大学本科生毕业设计（论文）
目 录
摘要 ........................................................................................................................... 1 前言 ........................................................................................................................... 3 1 材料和方法 ........................................................................................................... 3 1.1 材料及主要试剂 ................................................................................................ 4 1.2 方法 .................................................................................................................... 4 1.2.1 引物设计 ......................................................................................................... 4 1.2.2 PCR扩增目的片段 ........................................................................................ 4 1.2.3 目的片段的分离和回收（Takara回收试剂盒） ........................................ 5 1.2.4 酶切反应 ......................................................................................................... 5 1.2.5 连接反应 ......................................................................................................... 5 1.2.6 感受态细胞制备 ............................................................................................. 6 1.2.7 连接产物的转化 ............................................................................................. 6 1.2.8 试剂盒抽提质粒DNA ................................................................................... 6 1.2.9 重组质粒的鉴定及测序 ................................................................................. 6 1.2.10 原核表达 ....................................................................................................... 7 1.2.11 SDS-PAGE蛋白电泳 ................................................................................... 7 2 结果 ....................................................................................................................... 8 2.1 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆 ....................................................... 8 2.2 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析 ....................................................... 9 2.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定 ................................................................... 12 2.4 蛋白质表达与SDS-PAGE分析 ..................................................................... 13 2.5 Western Bloting分析........................................................ 错误！未定义书签。 3 讨论 ..................................................................................................................... 14 参考文献： ............................................................................................................. 15 致 谢 ..................................................................................................................... 16 附录1. .................................................................................................................... 19 附录2. .................................................................................................................... 20
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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达
摘 要
本研究以家蚕中大造品种为材料，以其 cDNA为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin-2基因；采用大肠杆菌原核表达系统（BL21）进行家蚕Serpin-2基因的表达研究。主要结果如下：
根据已知野蚕Serpin-2（GenBank登录号：AF242200.1）序列设计合适的引物，采用PCR方法克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析表明，家蚕Serpin-2基因编码区长度为990bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75 kDa，等电点约为4.67。与家蚕
Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度高达99.29%，氨基酸序列相似度高达98.93%，
推测家蚕Serpin-2与野桑蚕Serpin-2基因起着相同或类似的作用。
将家蚕大造Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌BL21中，经1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明，经IPTG诱导转化家蚕Serpin-2的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带，相对分子量约44 kDa，与预计的大小相符，证实家蚕
Serpin-2在大肠杆菌中得到表达。
家蚕Serpin-2基因的成功克隆和原核表达研究为从分子水平上解析Serpin在野桑蚕体内的功能打下了基础。
关键词：家蚕；Serpin-2；基因克隆；原核表达
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Cloning and prokaryotic expression of Serpin-2 gene of Bombyx
mori
Abstract
In this study，the gene of Serpin in Bombyx mori (Serpin-2) was cloned by PCR using the whole body cDNAs as templates. E.coli prokaryotic expression system was used for expression study of serpin-2 gene. The main results are as follows:
According to the sequence of Bombyx mandarina serpin-2 gene, proper primer was designed and Serpin-2 gene of Bombyx mori（The GenBank accession numbers：AF242200.1）was cloned by PCR. According to sequence analysis, the 990bp coding region of Serpin-2 encoding 329 amino acid residues results in theoretical molecular weight of 43.75 kDa, isoelectric point of 4.67. Comparied to the Serpin-2 gene of Bombyx mori and Bombyx mandarina，the gene identity and amino acid identity reach 98.7%，respectively. It reveals that Serpin-2 of Bombyx mori and Bombyx mandarina may play a same or similar role.
The Serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector pET-28a（+） and then transformed into E. coli BL21(DE3). And 1mmol/L IPTG was used to induce the target protein to express. SDS-PAGE analysis indicated that there was a specific band with relative molecular weight of 44 kDa on PAGE profiles for the BL21 with Serpin-2 induced by IPTG, comparied to the contract BL21 and BL21 with empty pET-28a(+)，which confirmed that the Serpin-2 gene was successfully expressed.
The successful cloning and prokaryotic expressing research of Serpin-2 gene in Bombyx mori has established the foundation for analying the fuction of Serpin in Bombyx mori.
Key words: Bombyx mandarina; Serpin-2; cloning; prokaryotic expression
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前 言
丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年衍变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂，是一种球状蛋白，并且各种Serpins大约有30％的序列同源性，疏水区同源性高达70％[2]。目前，大约已有500 种Serpins 在动物、微生物、病毒和植物中得到鉴定（Irving JA， et al.， 2000）。 由350至500个氨基酸组成并且有着高度保守的三级结构[3]。该抑制剂已陆续在真核生物，细菌和病毒中得到鉴定，而其超家族很多成员也被鉴定存在于病毒、植物和动物细胞组织中，而这些成员中大多数都是从哺乳动物血浆中分离的，它们大多与凝血过程有关[4]。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶的活性而参与了许多基本的生命活动，已经被广泛应用于农业、医药和食品等行业，对昆虫的生命活动也至关重要。
Serpin在昆虫的头部、精巢和卵巢中的含量也很丰富，甚至在丝腺，中肠中也有分布，并且在受到外界微生物刺激时Serpin在昆虫的血淋巴和脂肪体中大量表达（Tong Y and Kanost MR， 2005； Aratake H， et al.， 1990； Zou and Jiang， 2005）。有报道证明，一些Serpins在血细胞的细胞质中表达，也有一些Serpins蛋白在细胞内产生作用，定位于细胞质或细胞质和细胞核之中（Tong Y and Kanost MR， 2005； 樊净， 2003） 。近10年来，昆虫Serpin分子水平的研究进展很快，但与哺乳动物相比，其新基因的发现、基因结构分析、表达调控和基因功能的研究较少，对于有些基因的功能机制还不清楚，在鳞翅目野桑蚕中的研究则更少[6]。
目前对家蚕serpin家族成员的研究主要集中在Serpin6（刘衬丽，许雅香等）、Serpin16（董照明，赵萍等）和Serpin4（查宏贤，许雅香等）。其中对Serpin2的研究主要在烟草天蛾，Tong和Kanost（2002）发现烟草天蛾serpin2A参与免疫反应，抑制多种血淋巴蛋白酶，如烟草天蛾Serpin2抑制了血液中酚氧化酶原的活化级联反应；使用革兰氏阴性菌和阳性菌刺激烟草天蛾后，Serpin2与血液中的HP1形成复合物；并且，Serpin2还同时与HP21以及另外两个未鉴定的蛋白酶形成复合物。Zou等（2009）将家蚕34条serpin进行了进化分析，发现家蚕Serpin2与烟草天蛾的Serpin2A有较高同源性。
为此本课题拟对家蚕Serpin2基因作较详细有研究，主要集中在基因克隆，序列分析比对。为研究家蚕Serpin2蛋白的功能打下基础。本研究计划利用基因Bank获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin2）基因序列、通过已知序列设计引物。利用PCR技术基因克隆技术扩增并克隆家蚕Serpin2基因。经基因测序，对序列进行分析和比对。从而达到研究目的。
[3]
1.材料和方法
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1.1 材料及主要试剂
家蚕（大造）cDNA、宿主菌E．coli TG1菌种、BL21菌皆为苏州大学特种经济动物饲养实验室保存。
克隆载体pUCm-T为Takara公司产品；原核表达载体pET-28a（+）由本实验室保存。PCR试剂盒（内含Taq酶、dNTPmix、10×buffer等）、凝胶回收试剂盒、250 bp
DNA Marker、100bp-6000bp DNA Ladder Marker、限制性内切酶Hind3、BamH1
和T4 DNA Ligase为宝生物工程(大连)有限公司产品；蛋白质Marker为Promega公司产品；小牛血清白蛋白为上海生工生物工程有限公司产品；质粒小量快速抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品。
NCBI的Blast工具；ExPASy在线ScanProsite程序（http://www.expasy. org/tools/pi_tool.html）；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在线程序；DNAMAN软件；Tanon Gis凝胶图像处理系统。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据家蚕Serpin-2序列设计一对引物扩增野桑蚕Serpin-2基因的ORF区域。 正向引物SPN2F：5’-CCCAAGCTTTCAATTTCGTCCACG-3’ 反向引物SPN2R：5’-CGCGGATCCATGGATTCAAAGGCT-3’
1.2.2 PCR扩增目的片段
a. 在离心管中，按照Takara公司Taq酶的使用说明进行如下操作：
ddH2O
10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) dNTP混合物(每种10 mmol/L) Serpin2F Serpin2R
模板cDNA
35.5 μL 5 μL 4 μL
2 μL (10 μmol/L) 2 μL (10 μmol/L) 1 μL（约0.1～0.2 μg） 0.5 μL
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La×Taq酶