苏州大学本科生毕业设计（论文）
比分析，发现基因在相似部分碱基重合度为98.7%（图5）
图5野桑蚕和家蚕Serpin-2基因相似部分对比分析
（红色竖线表示碱基相同）
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又如图6所示，测得的家蚕Serpin-2基因的ORF长度为987 bp，编码329个氨基酸残基。其蛋白质预测分子量约为 43.75 kDa，等电点约为4.67。
10 20 30 40 50 60
1 ATGGATTCAAAGGCTTTATCCTCTGCAGTCACCAAGTTCTCTGCAAAGTTTTGCAATGAA 1 M D S K A L S S A V T K F S A K F C N E 70 80 90 100 110 120
61 CTGGATAAAAAGAAGAATGTTGTATCATCGCCATTGTCAGCAGAATACTTGCTGGCGTTG 21 L D K K K N V V S S P L S A E Y L L A L 130 140 150 160 170 180
121 ATAACTTTGGGAACTACTGATCCTGCACACGAAGAGCTATTGACAAGCCTAGGTATCCCG 41 I T L G T T D P A H E E L L T S L G I P 190 200 210 220 230 240
181 GATGATGACACGATTCGCTCATCATTCTCGGCTGTGTCGTCAAAATTGAAATCAATAAAA 61 D D D T I R S S F S A V S S K L K S I K 250 260 270 280 290 300
241 GGTGTTACGTTTAATGTAGCCAACGAAATATACATCAAGGAGGGTGACTATGAGCTCGAC 81 G V T F N V A N E I Y I K E G D Y E L D 310 320 330 340 350 360
301 CCAAAACTTAAGAAGGACGCTGTCGAGGTATTCGATGCAGATTTTGAAAAAGTTGACTTC 101 P K L K K D A V E V F D A D F E K V D F 370 380 390 400 410 420
361 GATAACGGAGCCGCAGCCGCCGGCCTAATAAACAAATGGGTTGAAAATAAAACAAATGAA 121 D N G A A A A G L I N K W V E N K T N E 430 440 450 460 470 480
421 CGTATTAAAGATCTCTTGAGTGAAGACAGCCTCGATTCGTATACGCGTTTGGTTTTGGTC 141 R I K D L L S E D S L D S Y T R L V L V 490 500 510 520 530 540
481 AACGCTCTCTACTTCAAGGGTACATGGCAAAACCAGTTCGACTCTATAAGCACCATGGAG 161 N A L Y F K G T W Q N Q F D S I S T M E 550 560 570 580 590 600
541 CGACCGTTCTATGTTGACACCGAAACGACAGTTAATATTCCTATGATGTACCAAGAAAAT 181 R P F Y V D T E T T V N I P M M Y Q E N 610 620 630 640 650 660
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601 AATTTCAAGTATGGTGAGAGCCACGACCTCAATGCGCAGTTACTTGAAATGGCGTATGAA 201 N F K Y G E S H D L N A Q L L E M A Y E 670 680 690 700 710 720
661 GGTAACGATGCCAGCATGGTTATCGTGCTGCCGAACGAAATTAATGGCCTGGACGGGATA 221 G N D A S M V I V L P N E I N G L D G I 730 740 750 760 770 780
721 CTGCAGAAGCTGGCCGATGGCTACGACCTAACTTCGGAACTGGACAAAATGTTCTCGACC 241 L Q K L A D G Y D L T S E L D K M F S T 790 800 810 820 830 840
781 AAAGTGCGAGTGACGGTGCCGAAATTCAAGATCGAAACTGAGATTGATCTACTTCAAGTT 261 K V R V T V P K F K I E T E I D L L Q V 850 860 870 880 890 900
841 TTGCCCAAGTTGGGTATTCAGGCGATCTTCAACCGCCAGAATTCCGGTCTGACCAAGATC 281 L P K L G I Q A I F N R Q N S G L T K I 910 920 930 940 950 960
901 TTGGATAACGACGAGCCGCTGTACGTATCCAAGGCTGTGCAAAAAGCCTTCATTGAAGTC 301 L D N D E P L Y V S K A V Q K A F I E V 970 980 990 1000 1010 1020 961 AACGAGGAAGGCGCCGAAGCAGCCGCCTGA 321 N E E G A E A A A *
图
6家蚕Serpin-2基因的cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列
（星号（＊）表示终止密码子）
2.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定
将PCR产物回收纯化后连接进pET-28a（+）原核表达载体；重组质粒经Hind3 、BamH1双酶切鉴定，结果如图（6）。在约1.2 kb大小位置出现了一条条带，与预期结
果相一致。
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图6 野桑蚕Serpin-2基因表达重组质粒酶切鉴定
M. DNA marker；1.带有目的片段的pET-28a载体酶切结果
2.4 serpin-2的蛋白质原核表达SDS-PAGE分析
家蚕Serpin-2重组转化菌经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析如图7所示，在
40～50 kDa大小位置诱导转化目的基因Serpin-2的BL21菌与对照组BL21(DE3)菌、
空pET-28a(+)转化BL21(DE3)菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带(图7中箭头所指)，而预测的野桑蚕Serpin-2蛋白分子量约为43.75 kDa,与预期的所要表达的Serpin-2蛋白分子量大小相符，推测家蚕Serpin-2基因在大肠杆菌中得到成功表达。
图7 Serpin-2基因表达产物的SDS-PAGE电泳和Western Blot分析
M．蛋白质Marker；1．无质粒转化的BL21菌的表达; 2. 空载体pET-28a转化BL21
菌后的表达；3.经1mM IPTG诱导的pET-28a-Serpin-2的表达；
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3 讨论
家蚕( Bombyx mori L. )和 野桑蚕( Bombyx mandarina Moore) 同属鳞翅目家蚕蛾科。研究证明,家蚕与野桑蚕的血缘十分亲近[7]，根据野桑蚕Serpin-2序列设计引物，采用PCR方法成功克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析表明，家蚕Serpin-2基因编码区长度为987 bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75 kDa，等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度达99.29%，有8个基因不同；氨基酸序列相似度达98.93%，4个氨基酸残基有差异。推测野桑蚕与家蚕Serpin-2起着相同或类似的作用。
将野桑蚕Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌
BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳表明，野桑蚕Serpin-2在大肠
杆菌中成功表达，蛋白相对分子量约44kDa，与推导的蛋白分子量相符。pET-28a（+）作为原核表达载体，它含有T7启动子，是一种T7噬菌体表达系统，具有能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因的优点，而且其转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，大量表达目的蛋白。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点，可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白，从而获得重组的目的蛋白，是一种较好的表达载体。与真核表达系统相比，具有成本低廉，操作简单，容易培养，生产周期短，易于获得高水平表达蛋白的优点[8]。本研究成功构建了含有Serpin-2基因完整ORF序列的原核表达载体，并且目的基因在原核大肠杆菌细胞中成功表达，为进一步对该表达产物的活性分析及相关功能研究提供了参考。
目前，昆虫Serpin-2的功能特性尚无清晰的研究和认证，鉴于Serpin超家族成员的同源性较高，可以从研究该家族中其他成员着手，探索研究Serpin-2的生理功能。很多实验表明Serpin 在昆虫中具有一定的免疫作用。它们与丝氨酸类蛋白酶形成非共价复合物，在局部发生黑化反应，阻止丝氨酸蛋白酶的级联反应，从而抑制多酚氧化酶原的激活，发挥它们的免疫功能[9]。
经分析，该野桑蚕Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列。信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中[10]。该研究中Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列表明它在细胞内起作用，这一点跟烟草天蛾Serpin-2有共同之处。烟草天蛾Serpin-2是一种细胞内蛋白质[11]，在细菌刺激后，该基因在血细胞的细胞质中表达[12]。野桑蚕Serpin-2在细胞内的调控网络中如何发挥作用，其具体调节机制和功能还有待更进一步研究。
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